Name: bromodeoxyuridine (brdu) labeling and subsequent fluorescence activated cell sorting for culture-independent identification of dissolved organic carbon-degrading bacterioplankton
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degradin

Finansieringen av detta projekt från National Science Foundation OCE1029607 (till XM) och MCB0702125 (till MAM) och Gordon och Betty Moore Foundation (till MAM).

1. Vattenprov bearbetning <ol><li> Filtrera 10L miljömässiga vatten genom 1 mikrometer-por-storlek membranfilter att ta bort större partiklar och bacteriovores. Samla upp vattnet filtratet i en Damejeanne. </li><li> Överför 36 ml filtrat varje del i 3 sterila Eppendorf-rör (50 ml) innehållande 4 ml nygjord paraformaldehyd lösning (PFA, 10%). Inkubera i 2 timmar i rumstemperatur för att bevara celler. Samla cellerna på 0,22-ìm-por-storlek vit membranfilter av vakuumfiltrering. Tvätta filtret genom att passe...

<ol>
	<li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton.">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li><li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria.">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li><li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater.">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li><li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities.">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li><li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+(BrdU)+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+(Exo+III)+digestion.">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li><li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR.">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li><li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+stains:+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells.">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li><li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae.">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li><li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean.">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li><li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations.">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li><li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li></ol>

Vår strategi par BrdU bolagsordning, FACS och 16S rDNA analys att tillåta arter nivå identifiering av bakterioplankton att metabolisera individuella DOC komponenter i vattenmiljöer. Den BrdU inbyggnad analys etiketter bakterieceller baserat på ämnesomsättning, vilket gör att analysen endast på aktiva bakterier och därför inte ingår vilande celler. I vårt tillvägagångssätt är BrdU ingå i situ immunodetected och bakterier som har olika nivåer av BrdU inbyggnad därefter visualiseras, grupperas ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Typ </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinas K </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P2308-25 MG </td><td></td></tr><tr><td> In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS </td><td> Kit </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Konsumera mer av Anti-BrdU-FLUOS och inkubation buffert per reaktion än vad tillverkaren. </td></tr><tr><td> Ram-Seal Inkubering Chambers </td><td> Material </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> Polykarbonatmembranfilter (142 mm diameter, 1,0 ìm-por-storlek) </td><td> Material </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> Polykarbonatmembranfilter (25-mm diameter, 0,2 ìm-por-storlek) </td><td> Material </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Pärlor </td><td> Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick gel utvinning kit </td><td> Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28.704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe PCR System </td><td> Kit </td><td> EPICENTRUM </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) labeling and subsequent fluorescence activated cell sorting for culture-independent identification of dissolved organic carbon-degrading bacterioplankton

Mikroberna är stora aktörer förmedla nedbrytning av många löst organiskt kol (DOC) substrat i akvatiska miljöer. Dock innebär identifiering av bakterier taxa som omvandlar vissa pooler av DOC i naturen en teknisk utmaning. Här beskriver vi ett arbetssätt som par bromodeoxyuridine (BrdU) bolagsordning, fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) och 16S rRNA gen-baserad molekylär analys som gör att kultur-oberoende identifiering av bakterioplankton kan förnedrande en specifik DOC förening i vattenmiljöer. Tre exemplar bakterioplankton mikrokosmos är konfigurerade för att ta emot både BrdU och en modell DOC förening (DOC ändringar), eller bara BrdU (no-tillägg kontroll). BrdU substitut positioner tymidin i nya syntetiseras bakterie-DNA och BrdU-märkt DNA kan lätt immunodetected 1,2. Genom en 24-timmars inkubation bakterioplankton som kan använda de extra DOC föreningen förväntas vara selektivt aktiveras, och därför har högre nivåer av BrdU bolagsordning (HI celler) än icke-känslig celler i DOC ändringar och celler i no- Förutom kontroller (låg BrdU införlivande celler, LI celler). Efter fluorescens immunodetection är HI celler urskiljas och fysiskt separerade från LI cellerna genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) 3. Sorterade DOC-känslig celler (HI celler) utvinns för DNA och taxonomiskt identifieras genom efterföljande 16S rRNA gen-analyser inklusive PCR, klon bibliotek konstruktion och sekvensering.

Watch this Scientific Journal Video about Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degradin

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Miljö bakterioplankton inkuberas med en modell som löst organiskt kol (DOC) förening och ett DNA-märkning reagens, bromodeoxyuridine (BrdU). Efteråt är DOC-nedbrytande celler skilda från huvuddelen gemenskapen som baseras på förhöjda BrdU införlivande med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Dessa celler är sedan identifieras med efterföljande molekylära analyser.

Bromodeoxyuridine (BrdU) märkning och Efterföljande Fluorescens Aktiverat cellsortering för kultur-oberoende identifiering av löst organiskt kol-nedbrytande bakterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Generation of Human CD40-activated B cells

Generering av Human CD40-aktiverade B-celler

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell särskild analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blad Använda fluorescensaktiverad cellsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolering av normala och cancer-associerade fibroblaster från färska vävnader genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sortering av<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cell Pellets Använda en komplex Object parametrisk Analyzer och Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanoguld Märkning av jäst endosomal System för Ultra Analyser

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvensspecifik Märkning av nukleinsyror och proteiner med metyltransferaser och kofaktor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...