Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح لDMH وTDM (NHMRC منح المشاريع). DMH زميل Grimwade ، بتمويل من صندوق Miegunyah.

1. إعداد الخلايا لوصفها مع ReAsH / فلاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام معيار طرق زراعة الخلايا للخط الخلوي من الفائدة ، وتعد الثقافة من الخلايا الملتصقة مباشرة في شريحة التصوير الخلية الحية على استعداد لترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

نهج التعريب البروتين التسمية مع بروتين فلوري وخصائص متعلق بتكوين مع صبغة second تقدم إمكانات كبيرة لرسم الخرائط حيث التشكل مختلفة من بروتينات تتراكم في الخلايا والأحداث التي تغير ديناميات التشكل البروتين. وقد استخدم لأول مرة ReAsH / فلاش وجهاز استشعار في الخلية للطي البر...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> 8 - جيدا μ - الشرائح </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> نجد هذه الشرائح الغرفة لتكون مفيدة بشكل خاص لزراعة الخلايا للتصوير. </td></tr><tr><td> TC - FLASH الثاني في الخلية Tetracysteine ​​كشف العلامات كيت * * * مضان أخضر للخلية الحية التصوير </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (فلاش) أو T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> هانكس &quot;محلول الملح المتوازن </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2،3 - Dimercapto - 1 - بروبانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D1129 - 5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1،2 - Ethanedithiol </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 02390 - 25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

البروتينات الفلورية والأصباغ وأدوات أساسية لدراسة توطين البروتين والاتجار بها وظيفة في الخلايا. في حين تم البروتينات الفلورية مثل البروتين مضان أخضر (GFP) المستخدمة على نطاق واسع باعتبارهم شركاء الانصهار للبروتينات لتتبع خصائص بروتين المصالح 1 ، والتطورات الأخيرة مع أصغر به تمكين وظائف جديدة من البروتينات التي يتعين بحثها في الخلايا مثل تغيير متعلق بتكوين والبروتين وتكوين الجمعيات 2 ، 3. نظام واحد ينطوي على سمة صغيرة عزر tetracysteine ​​(CCXXCC) إدراج وراثيا في البروتين المستهدف ، والذي يربط biarsenical الأصباغ ، ReAsH (أحمر فلوري) وفلاش (الفلورية الخضراء) ، مع خصوصية عالية حتى في الخلايا الحية 2. نظام صبغ TC / biarsenical عروض قيود أقل بكثير الفراغية للبروتين المضيف من البروتينات الفلورية التي مكنت عدة مقاربات جديدة لقياس التغيير متعلق بتكوين والبروتين البروتين التفاعلات 4-7. نحن وضعت مؤخرا تطبيق الرواية من العلامات TC وأجهزة الاستشعار من oligomerization في الخلايا معربا عن huntingtin متحولة ، والتي عندما تحولت المجاميع في الخلايا العصبية في مرض هنتنغتون 7. وكان الموسومة Huntingtin مع اثنين من الأصباغ الفلورية ، واحدة بروتين فلوري لتتبع مكان البروتين ، والثاني علامة TC الوحيد الذي يربط الأصباغ biarsenical في مونومرات. وبالتالي ، تمكين تغييرات في colocalization بين البروتين والتفاعل صبغ biarsenical قليل وحدات غير مرئي بالمجهر المحتوى ليتم تعيينها مكانيا داخل الخلايا. هنا ، نحن تصف كيفية تسمية TC - الموسومة بروتينات تنصهر لبروتين فلوري (الكرز ، أو GFP CFP) مع فلاش أو ReAsH في خلايا الثدييات الحية وكيفية قياس مضان اللون اثنين (الكرز / فلاش ، CFP / فلاش أو GFP / تركيبات ReAsH).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

والأصباغ biarsenical الفلاش وReAsH خصيصا لربط الزخارف tetracysteine ​​في البروتينات ، ويمكن تسمية انتقائي البروتينات في الخلايا الحية. مؤخرا تم استخدام هذه الاستراتيجية لتطوير أجهزة الاستشعار التوسيم لبروتين مختلفة التشكل أو الدول oligomeric. وصفنا نهج وضع العلامات وطرق لتحليل كمي ملزمة.

ReAsH / فلاش الوسم وتحليل صورة البروتينات في خلايا الاستشعار Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

التحليل الآلي من ديناميك كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; إشارات في تسلسلات الصور

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

وضع العلامات المناعية للفيروسات النباتية وبروتينات ناقلات الحشرات في الأمعاء النصفية

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...