Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan DMH en TDM (NHMRC projectsubsidies). DMH is een Grimwade Fellow, gefinancierd door de Miegunyah Trust.

1. De voorbereiding van cellen voor het labelen met ReAsH / Flash <ol><li> Met behulp van standaard celcultuurmethoden voor uw cellijn van belang zijn, voor te bereiden van een cultuur van hechtende cellen direct in een live-cell imaging slide klaar voor transfectie. </li><li> Transfecteren uw plasmide dat TC-gelabeld gen van belang op basis van uw transfectie methode van keuze. </li></ol> Nota is het belangrijk om positieve en negatieve controles te gebruiken om de mate van specifieke binding ...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

De aanpak van label eiwit lokalisatie met een fluorescerend eiwit en conformationele eigenschappen met een tweede kleurstof biedt veel mogelijkheden voor in kaart brengen van waar verschillende conformaties van eiwitten opbouwen in cellen en evenementen die de dynamiek van eiwit conformatie te veranderen. ReAsH / Flash werd voor het eerst gebruikt als een in-cel-sensor voor het vouwen van eiwitten van de zoogdieren cellulaire retinoïnezuur-bindend eiwit I 4. In dit voorbeeld is de FLASH gebonden aan een TC t...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 8-well μ-slides </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> We vinden deze kamer dia&#39;s aan met name nuttig zijn voor het kweken van cellen voor beeldvorming. </td></tr><tr><td> TC-Flash II In-cel Tetracysteine ​​Tag Detection Kit * groene fluorescentie * * voor live-cell imaging </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) of T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Balanced Salt Hanks &#39;Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Fluorescerende eiwitten en kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor de studie van proteïne mensenhandel, lokalisatie en functie in cellen. Terwijl fluorescerende eiwitten zoals groene fluorescentie eiwit (GFP) zijn uitgebreid gebruikt als fusiepartners om eiwitten aan de eigenschappen van een eiwit van belang een, recente ontwikkelingen track met kleinere labels in staat stellen nieuwe functionaliteiten van eiwitten worden onderzocht in cellen, zoals conformationele verandering en eiwit-vereniging 2, 3. Een kleine tag-systeem omvat een tetracysteine ​​motief (CCXXCC) genetisch ingebracht in een doelwit eiwit, dat bindt aan biarsenical kleurstoffen, ReAsH (rood fluorescerend) en Flash (green fluorescent), met een hoge specificiteit, zelfs in levende cellen 2. De TC / biarsenical dye-systeem biedt veel minder sterische beperkingen op de host eiwit dan fluorescerende eiwitten die in staat heeft gesteld een aantal nieuwe benaderingen van conformationele verandering en eiwit-eiwit interacties 4-7 te meten. We hebben onlangs een nieuwe toepassing van TC tags als sensoren van oligomerisatie in cellen die mutant huntingtine, die, wanneer gemuteerd aggregaten in neuronen in de ziekte van Huntington 7. Huntingtine werd getagd met twee fluorescente kleurstoffen, een een fluorescerend eiwit bewerkt om locatie volgen, en de tweede een TC-tag die alleen biarsenical kleurstoffen bindt in monomeren. Vandaar dat veranderingen in de colocalization tussen eiwit en biarsenical kleurstof reactiviteit ingeschakeld submicroscopische oligomeer inhoud ruimtelijk in kaart worden gebracht in de cellen. Hier beschrijven we hoe de TC-gemerkte eiwitten gefuseerd met een fluorescerend eiwit (Cherry, GFP of GVB) met Flash of ReAsH in levende zoogdiercellen en hoe je de twee kleuren fluorescentie (Cherry / Flash, GVB / Flash of GFP / kwantificeren label ReAsH combinaties).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

De biarsenical kleurstoffen Flash en ReAsH binden specifiek aan tetracysteine ​​motieven in eiwitten en kan selectief label eiwitten in levende cellen. Onlangs is dit de etikettering strategie is gebruikt om sensoren voor verschillende eiwitten conformaties of oligomere staten te ontwikkelen. Beschrijven we de etikettering van aanpak en methoden om kwantitatief te analyseren bindend.

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in reeksen afbeeldingen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Immunofluorescente etikettering van plantenvirussen en insectenvectoreiwitten in hemipterandarmen

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine Sensor eiwitten in cellen