Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
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Ce travail a été financé par des subventions aux DMH et TDM (NHMRC subventions de projet). DMH est Fellow Grimwade, financé par la Fiducie Miegunyah.

1. Préparation des cellules pour le marquage avec ReAsH / Flash <ol><li> En utilisant des méthodes standard de culture cellulaire pour votre lignée cellulaire d&#39;intérêt, de préparer une culture de cellules adhérentes directement dans une diapositive imagerie des cellules vivantes prêtes pour la transfection. </li><li> Transfecter votre plasmide contenant TC-taggés gène d&#39;intérêt en fonction de votre méthode de transfection de choix. </li></ol> Notez qu&#39;il est important ...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

L&#39;approche de la localisation de la protéine étiquette avec une protéine fluorescente et les propriétés conformationnelles avec un second colorant offre beaucoup de potentiel pour la cartographie où les différentes conformations de protéines s&#39;accumulent dans les cellules et les événements qui changent la dynamique de la conformation des protéines. ReAsH / Flash a été d&#39;abord utilisé comme un capteur de cellules pour le repliement des protéines cellulaires de mammifères de l&#39;acide rétino...

<table border="1"><tbody><tr><th> Le nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 8-même μ-diapositives </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Nous trouvons ces diapositives de chambre pour être particulièrement utile pour la culture de cellules pour l&#39;imagerie. </td></tr><tr><td> TC-Flash II dans la cellule de détection Tag Tetracysteine ​​Kit * * * fluorescence verte pour imagerie des cellules vivantes </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) ou T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-dimercapto-1-ol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-éthanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Les protéines fluorescentes et les colorants sont des outils essentiels pour l&#39;étude du trafic des protéines, la localisation et la fonction des cellules. Alors que les protéines fluorescentes telles que la fluorescence protéine verte (GFP) ont été largement utilisés en tant que partenaires de fusion aux protéines de suivre les propriétés d&#39;une protéine d&#39;intérêt de 1, les développements récents avec de petites balises permettent de nouvelles fonctionnalités de protéines pour être examinés dans les cellules, comme le changement conformationnel et en protéines d&#39;association 2, 3. Un système de petite étiquette comporte un motif tetracysteine ​​(CCXXCC) génétiquement inséré dans une protéine cible, qui se lie aux colorants biarsenical, ReAsH (rouge fluorescent) et Flash (vert fluo), avec une spécificité élevée même dans des cellules vivantes 2. Le système TC / biarsenical colorant offre beaucoup moins de contraintes stériques de la protéine de l&#39;hôte que les protéines fluorescentes qui a permis à plusieurs nouvelles approches pour mesurer les changements de conformation et d&#39;interactions protéine-protéine 4-7. Nous avons récemment développé une nouvelle application de balises TC que les capteurs d&#39;oligomérisation dans les cellules exprimant la huntingtine mutante, qui, lorsqu&#39;il est muté agrégats dans les neurones dans la maladie de Huntington 7. La huntingtine a été marqué avec deux colorants fluorescents, un pour une protéine fluorescente pour suivre la localisation des protéines, et le second un tag TC qui ne lie que les colorants biarsenical dans les monomères. Par conséquent, les changements dans colocalisation entre la protéine et la réactivité de teinture biarsenical permis teneur en oligomères submicroscopiques à être spatialement cartographié l&#39;intérieur des cellules. Ici, nous décrivons comment étiqueter TC-protéines étiquetées fusionné à une protéine fluorescente (Cherry, la GFP ou PCP) avec le flash ou ReAsH en direct les cellules de mammifères et de la façon de quantifier la fluorescence à deux couleurs (Cherry / Flash, CFP / Flash ou GFP / combinaisons ReAsH).

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Les colorants biarsenical Flash et ReAsH se lient spécifiquement aux motifs tetracysteine ​​en protéines et peut sélectivement l&#39;étiquette protéines dans les cellules vivantes. Récemment, cette stratégie d&#39;étiquetage a été utilisé pour développer des capteurs pour les conformations de protéines différentes ou des états oligomériques. Nous décrivons la méthode d&#39;étiquetage et des méthodes pour analyser quantitativement contraignant.

ReAsH / Flash d&#39;étiquetage et d&#39;analyse d&#39;images de protéines dans les cellules du capteur Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

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