Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Stipendien an DMH und TDM (NHMRC Projekt Zuschüsse) finanziert. DMH ist ein Grimwade Fellow, durch die Miegunyah Trust finanziert.

1. Vorbereitung der Zellen für die Kennzeichnung mit ReAsH / Flash <ol><li> Mit Standard-Zellkultur-Methoden für Ihre Zelllinie von Interesse, bereiten eine Kultur von adhärenten Zellen direkt in einem Live Cell Imaging Rutsche bereit für die Transfektion. </li><li> Transfizieren Ihre Plasmid TC-markierten Gen von Interesse nach Ihren Transfektion Methode der Wahl. </li></ol> Hinweis Es ist wichtig, um positive und negative Kontrollen nutzen, um das Ausmaß der spezifischen Bindung an den T...

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	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

Der Ansatz zur Kennzeichnung Proteinlokalisierung mit einem fluoreszierenden Protein und konformativen Eigenschaften mit einem zweiten Farbstoff bietet viel Potenzial für die Zuordnung, wo verschiedene Konformationen von Proteinen in Zellen und Ereignisse, die die Dynamik der Protein-Konformation ändern anfallen. ReAsH / Flash wurde zuerst als in-cell-Sensor für die Proteinfaltung von Säugetieren zelluläre Retinsäure-bindende Protein I 4 verwendet. In diesem Beispiel, das Flash gebunden an ein TC-Tag in...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 8-Well-μ-Slides </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Wir finden diese Kammer-Objektträgern sich als besonders nützlich zur Kultivierung von Zellen für die Bildgebung. </td></tr><tr><td> TC-Flash II In-cell Tetracysteinmotiv Tag Detection Kit * grüne Fluoreszenz * * für Live-Cell-Imaging </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) oder T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethandithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Fluoreszierende Proteine ​​und Farbstoffe sind wesentliche Instrumente für die Untersuchung von Protein Menschenhandel, Lokalisation und Funktion in Zellen. Während fluoreszierende Proteine, wie zB grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden intensiv als Fusionspartner an Proteine ​​verwendet werden, um die Eigenschaften eines Proteins von Interesse 1, die jüngsten Entwicklungen bei kleineren Tags ermöglichen neue Funktionalitäten von Proteinen in Zellen wie Konformationsänderung untersucht werden track und Protein-Vereins 2, 3. Ein kleiner Tag-System beinhaltet eine Tetracysteinmotiv Motiv (CCXXCC) genetisch in ein Zielprotein, das biarsenical Farbstoffe bindet eingefügt, ReAsH (rote Fluoreszenz) und Flash (grün fluoreszierend), mit hoher Spezifität auch in lebenden Zellen 2. Die TC / biarsenical Farbstoff-System bietet weit weniger sterische Einschränkungen an den Host-Protein als fluoreszierende Proteine, die mehrere neue Ansätze ermöglicht hat, Konformationsänderung und Protein-Protein-Interaktionen 4-7 messen. Wir haben vor kurzem eine neuartige Anwendung des TC tags als Sensoren der Oligomerisierung in Zellen, die mutierte Huntingtin, die, wenn mutierte Aggregate in Neuronen in Huntington-Krankheit 7. Huntingtin wurde mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen, einer ein fluoreszierendes Protein zu Protein Ort zu verfolgen und die zweite ein TC-Tag, das bindet nur biarsenical Farbstoffe in Monomeren getaggt. Daher aktiviert Veränderungen in Kolokalisation zwischen Protein und biarsenical Farbstoff Reaktivität submikroskopischen Oligomergehalt räumlich innerhalb von Zellen abgebildet werden. Hier beschreiben wir, wie TC-markierte Proteine ​​fusioniert an ein fluoreszierendes Protein (Cherry, GFP oder GFP) mit Flash oder ReAsH in Live Säugetierzellen und wie die beiden Farben-Fluoreszenz (Cherry / Flash, CFP / Flash oder GFP / quantifizieren Label ReAsH Kombinationen).

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Die biarsenical Farbstoffe Flash und ReAsH binden spezifisch an Tetracysteinmotiv Motive in Proteinen und kann wahlweise Label Proteine ​​in lebenden Zellen. Kürzlich diese Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Sensoren für verschiedene Proteinkonformationen oder oligomeren Zustände zu entwickeln. Wir beschreiben die Label-Ansatz und Methoden zur quantitativen Analyse bindend.

ReAsH / Flash Labeling und Bildanalyse von Tetracysteinmotiv Sensor Proteinen in Zellen

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Forschung

Biologie

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

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Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Immunfluoreszenzmarkierung von pflanzlichen Virus- und Insektenvektorproteinen in Hemipteren-Eingeweiden

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...