Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי מענקים DMH ו TDM (NHMRC מענקים הפרוייקט). DMH הוא עמית Grimwade, שמומן על ידי הקרן Miegunyah.

1. הכנת תאים עם תיוג ReAsH / פלאש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת שיטות סטנדרטיות תרבות התא לקו הנייד של עניין, להכין התרבות של תאים חסיד ישירות שקופיות הדמיה לחיות התא מוכן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect פלסמיד המכיל שלך TC-tagged הגן של עניי...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

הגישה לוקליזציה חלבון תווית עם חלבון פלואורסצנטי ומאפיינים קונפורמציה עם צבע שנייה מציע הרבה פוטנציאל למיפוי בו תצורות שונות של חלבונים בתאים לצבור ואירועים לשנות את הדינמיקה של קונפורמציה בחלבון. ReAsH / פלאש שימש לראשונה כחיישן ב-cell עבור קיפול חלבונים של חלבון יונק?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 8-μ היטב-שקופיות </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> אנו מוצאים קאמרית אלה שקופיות להיות שימושי במיוחד עבור תאים culturing הדמיה. </td></tr><tr><td> TC-Flash השנייה בתוך תא איתור Tetracysteine ​​תג קיט * * * פלואורסצנטי ירוק עבור לגור תאים הדמיה </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) או T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> הנקס &quot;פתרון מאוזן מלח </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-propanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D1129-5 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

חלבונים פלורסנט וצבעים הם כלים חיוניים לחקר לוקליזציה סחר, חלבונים לתפקד בתאים. בעוד חלבוני ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) נעשה שימוש נרחב כשותפים היתוך חלבונים כדי לעקוב אחר תכונות של חלבון של עניין 1, ההתפתחויות האחרונות עם תגיות קטנות מאפשרות פונקציות חדשות של חלבונים להיבחן בתאים כגון שינוי קונפורמציה וחלבון אסוציאציה 2, 3. אחת מערכת תג קטן כרוך מוטיב tetracysteine ​​(CCXXCC) מוכנס לתוך גנטית חלבון מטרה, אשר נקשר צבעים biarsenical, ReAsH (אדום ניאון) ו-Flash (ירוק זרחני), עם סגוליות גבוהה אפילו בתאים חיים 2. מערכת TC / biarsenical לצבוע מציעה אילוצים סטרית הרבה פחות חלבון מאשר לארח חלבוני ניאון אשר אפשרה מספר גישות חדשות כדי למדוד שינוי קונפורמציה ו חלבונים אינטראקציות 4-7. אנחנו לאחרונה פיתחה יישום הרומן של תגיות TC כמו חיישנים של oligomerization בתאים לבטא huntingtin מוטנטים, אשר כאשר מוטציה אגרגטים נוירונים מחלת הנטינגטון 7. Huntingtin היה מתויג עם שני צבעי ניאון, אחד חלבון פלואורסצנטי לעקוב אחר המיקום חלבון, ואת תג שנייה TC שרק נקשר צבעים biarsenical ב מונומרים. לפיכך, שינויים colocalization בין חלבון תגובתיות לצבוע biarsenical מופעלת תוכן oligomer submicroscopic להיות ממופה מרחבית בתוך התאים. כאן אנו מתארים כיצד תווית TC-tagged חלבונים התמזגו חלבון פלואורסצנטי (שרי, GFP או CFP) עם פלאש או ReAsH בתאי יונקים לחיות וכיצד לכמת את הקרינה two צבע (שרי / Flash, CFP / Flash או ה-GFP / ReAsH שילובים).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

צבעים biarsenical פלאש ReAsH להיקשר באופן ספציפי מוטיבים tetracysteine ​​בחלבונים והוא יכול סלקטיבי תווית חלבונים בתאים חיים. לאחרונה באסטרטגיה זו תיוג נעשה שימוש כדי לפתח חיישנים עבור תצורות חלבונים שונים או מדינות oligomeric. אנו מתארים את גישת התיוג ושיטות כמותית לנתח מחייב.

ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

תיוג אימונופלואורסצנטי של חלבונים וקטוריים של וירוסים צמחיים וחרקים במעיים המיפטרניים

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...