Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato da borse di DMH e TDM (NHMRC sovvenzioni per progetti). DMH è membro Grimwade, finanziato dal Trust Miegunyah.

1. Preparazione delle cellule per l&#39;etichettatura con ReAsH / Flash <ol><li> Usando metodi standard di coltura cellulare per la linea cellulare di interesse, preparare una coltura di cellule aderenti direttamente in una diapositiva dal vivo imaging cellulare pronto per la trasfezione. </li><li> Trasfezione vostro plasmide contenente TC-tagged gene di interesse in base al metodo di trasfezione di scelta. </li></ol> Nota è importante utilizzare i controlli positivi e negativi per valutare l&...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

L&#39;approccio alla localizzazione etichetta proteina con una proteina fluorescente e le proprietà conformazionali con un colorante secondo offre un grande potenziale per la mappatura in cui diverse conformazioni delle proteine ​​nelle cellule maturano e gli eventi che cambiano le dinamiche della conformazione delle proteine. ReAsH / Flash per la prima volta utilizzato come in-cell sensore per folding delle proteine ​​dei mammiferi cellulari retinoico-binding protein I 4. In questo esempio, il Flash...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 8-ben μ-slide </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Troviamo queste camera di diapositive di essere particolarmente utile per le celle di coltura per l&#39;imaging. </td></tr><tr><td> TC-Flash II nella cella di rilevamento Tag Tetracysteine ​​Kit fluorescenza verde * * * per il live-cell imaging </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) o T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Sale Hanks &#39;soluzione equilibrata </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-propanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Proteine ​​fluorescenti e coloranti sono strumenti essenziali per lo studio del traffico di proteine, la localizzazione e la funzione delle cellule. Mentre le proteine ​​fluorescenti come il verde proteina fluorescente (GFP) sono stati ampiamente utilizzati come partner di fusione di proteine ​​per monitorare le proprietà di una proteina di interesse 1, i recenti sviluppi con piccole etichette consentono nuove funzionalità di proteine ​​da esaminare nelle cellule, come il cambiamento conformazionale e proteine-associazione 2, 3. Un sistema di tag piccola comporta un motivo tetracysteine ​​(ccxxcc) geneticamente inserito in una proteina bersaglio, che si lega ai coloranti biarsenical, ReAsH (rosso fluorescente) e Flash (verde fluorescente), con elevata specificità anche nelle cellule vive 2. Il TC / biarsenical sistema colorante offre vincoli molto meno sterico alla proteina ospite di proteine ​​fluorescenti che ha permesso a numerosi nuovi approcci per misurare il cambiamento conformazionale e interazioni proteina-proteina 4-7. Abbiamo recentemente sviluppato una nuova applicazione di tag TC come sensori di oligomerizzazione nelle cellule che esprimono huntingtina mutata, che se mutato aggregati nei neuroni a Huntington malattia 7. Huntingtina era taggati con due coloranti fluorescenti, una una proteina fluorescente per tenere traccia posizione di proteine, e la seconda un tag TC che lega solo coloranti biarsenical in monomeri. Quindi, i cambiamenti colocalizzazione tra proteine ​​e biarsenical reattività colorante abilitato contenuto submicroscopiche oligomero di essere mappate spazialmente all&#39;interno delle cellule. Qui, descriviamo come etichettare TC-tagged proteine ​​fuse ad una proteina fluorescente (Cherry, GFP o CFP) con il flash o ReAsH in vivo le cellule di mammifero e come quantificare i due fluorescenza di colore (ciliegio / Flash, CFP / Flash o GFP / combinazioni ReAsH).

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Il biarsenical coloranti Flash e ReAsH legano specificamente ai motivi tetracysteine ​​di proteine ​​e in modo selettivo le proteine ​​etichetta in cellule vive. Recentemente questa strategia di etichettatura è stato utilizzato per sviluppare sensori per le diverse conformazioni delle proteine ​​o stati oligomerici. Abbiamo descritto l&#39;approccio di etichettatura e di metodi per analizzare quantitativamente vincolanti.

ReAsH / Flash Etichettatura e Image Analysis di proteine ​​sensore Tetracysteine ​​nelle celle

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

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ReAsH / Flash Etichettatura e Image Analysis di proteine ​​sensore Tetracysteine ​​nelle celle

ReAsH / Flash Etichettatura e Image Analysis di proteine sensore Tetracysteine nelle celle