Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
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Este trabalho foi financiado por doações de DMH e TDM (subvenções NHMRC projeto). DMH é um companheiro Grimwade, financiado pelo Fundo Miegunyah.

1. Preparação de células para a rotulagem com ReAsH / Flash <ol><li> Usando métodos de cultura de células padrão para sua linha de celulares de interesse, prepare uma cultura de células aderentes diretamente em um slide de imagens ao vivo de células pronto para transfecção. </li><li> Transfectar seu plasmídeo gene TC-tagged contendo de interesse de acordo com seu método de transfecção de escolha. </li></ol> Note que é importante o uso de controles positivos e negativos para avali...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

A abordagem para localização de proteínas rótulo com uma proteína fluorescente e propriedades conformacionais com um corante segundo oferece um grande potencial para o mapeamento de onde conformações diferentes de proteínas acumulam nas células e eventos que alteram a dinâmica da conformação protéica. ReAsH / Flash foi usado primeiramente como um sensor na célula para o dobramento de proteínas dos mamíferos celular proteína ácido retinóico-binding I 4. Neste exemplo, o Flash vinculado a um ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 8-μ bem-slides </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Encontramos estas câmara de slides a ser particularmente útil para a cultura de células para geração de imagens. </td></tr><tr><td> TC-FLASH II na célula Detecção Tag Tetracysteine ​​Kit * * * fluorescência verde para a imagem latente em células vivas </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) ou T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Solução de Hanks salina balanceada </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5mL </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Proteínas fluorescentes e corantes são ferramentas essenciais para o estudo da localização de proteínas, tráfico e função nas células. Enquanto que as proteínas fluorescentes, como a proteína fluorescente verde (GFP) têm sido amplamente utilizados como parceiros de fusão para proteínas para monitorar as propriedades de uma proteína de interesse 1, os desenvolvimentos recentes com etiquetas menores permitem novas funcionalidades de proteínas a ser examinada em células, tais como mudança conformacional e proteína-associação 2, 3. Um sistema de tag pequenas envolve um motivo tetracysteine ​​(CCXXCC) geneticamente inserido em uma proteína-alvo, que se liga aos corantes biarsenical, ReAsH (vermelha fluorescente) e Flash (verde fluorescente), com alta especificidade, mesmo em células vivas 2. O TC / biarsenical sistema de corante oferece muito menos restrições estérico à proteína do hospedeiro do que proteínas fluorescentes que tem possibilitado várias novas abordagens para medir a mudança conformacional e interações proteína-proteína 4-7. Recentemente, desenvolveu uma nova aplicação de tags TC como sensores de oligomerização em células que expressam mutante, que quando sofre mutação agregados nos neurônios em Huntington doença 7. Huntingtina foi etiquetado com dois corantes fluorescentes, uma uma proteína fluorescente para rastrear a localização de proteínas, e um segundo a marca TC que obriga apenas corantes biarsenical em monômeros. Assim, mudanças na co-localização entre as proteínas e reatividade corante biarsenical habilitado conteúdo oligômero submicroscópicas ser espacialmente mapeadas dentro das células. Aqui, descrevemos como rotular TC-tagged proteínas fundida a uma proteína fluorescente (Cherry, ou GFP PCP) com flash ou ReAsH viver em células de mamíferos e como quantificar a fluorescência de duas cores (Cherry / Flash, PCP / Flash ou GFP / combinações ReAsH).

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

O biarsenical corantes Flash e ReAsH se ligam especificamente a motivos tetracysteine ​​em proteínas e pode seletivamente rótulo proteínas em células vivas. Recentemente, esta estratégia de rotulagem tem sido usado para desenvolver sensores de conformações de proteínas diferentes ou estados oligoméricos. Descrevemos a abordagem rotulagem e métodos para analisar quantitativamente vinculativo.

ReAsH / Flash Rotulagem e Análise de Imagem Sensor de Proteínas em Células Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

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