Name: reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

Эта работа финансировалась за счет грантов для ДМГ и TDM (NHMRC проекту гранты). ДМГ является Гримвад сотрудник, финансируемый Miegunyah Trust.

1. Подготовка клеток для маркировки с ReAsH / Flash <ol><li> Используя стандартные методы клеточной культуры для вашего клеточной линии интересов, подготовить культуры прилипшие клетки непосредственно в живых изображений слайд клетка готова к трансфекции. </li><li> Трансфекции плазмиды, содержащ...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

Подход к этикетке локализации белка с флуоресцентным белком и конформационные свойства со вторым красителем предлагает большой потенциал для отображения, где разные конформации белков накапливаются в клетках и события, которые изменяют динамику конформации белка. ReAsH / Flash был впервы...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер по каталогу </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> 8-и μ-слайды </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Мы находим эти камерные слайды должны быть особенно полезно для культивирования клеток для работы с изображениями. </td></tr><tr><td> TC-Flash II В-клеток Обнаружение тегов Tetracysteine ​​Kit * зеленая флуоресценция * для живого-клеточного изображения </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) или T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Сбалансированный Соль Хэнкса Решение </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-пропанол </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5мл </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-этандитиола </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25МЛ </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Флуоресцентные белки и красителей являются необходимыми инструментами для исследования белков торговли людьми, локализации и функции в клетках. Хотя флуоресцентные белки, такие как зеленая флуоресценция белка (GFP), широко использовались в качестве партнеров для слияния белков отслеживать свойства белка интересов 1, последние события с меньшей теги позволяют новых функциональных белков должны быть рассмотрены в клетках, таких как изменение конформации и белково-ассоциации 2, 3. Одна маленькая система включает в себя теги tetracysteine ​​мотив (CCXXCC) генетически вставляется в целевой белок, который связывается с biarsenical красители, ReAsH (красный флуоресцентный) и Flash (зеленый флуоресцентный), с высокой специфичностью даже в живые клетки 2. TC / biarsenical красителя система предлагает гораздо меньше стерических ограничений на хост белка, чем флуоресцентные белки, что позволило несколько новых подходов для оценки конформационных изменений и белок-белковых взаимодействий 4-7. Недавно мы разработали новое применение ТК теги как датчики олигомеризации в клетках, экспрессирующих мутантный Huntingtin, который при мутировал агрегатов в нейронах в Хантингтон болезни 7. Huntingtin была помечена с двумя флуоресцентными красителями, один флуоресцентный белок отслеживать местоположение белка, а второй теги TC которые только связывает biarsenical красителей в мономеров. Следовательно, изменения в колокализации между белком и biarsenical красителя реактивность включен субмикроскопических содержание олигомеров быть пространственно отображается внутри клеток. Здесь мы опишем, как этикетка TC-меткой белков, слитый с флуоресцентный белок (вишня, GFP или CFP) со вспышкой или ReAsH в живых клетках млекопитающих и как количественно два цвета флуоресценции (вишня / Flash, CFP / Flash или GFP / ReAsH комбинации).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Biarsenical красителей вспышкой и ReAsH специфично связываются с tetracysteine ​​мотивов в белках и может выборочно этикетке белков в живых клетках. В последнее время эта маркировка стратегия была использована для разработки датчиков для различных конформаций белков или олигомерных государств. Мы описываем маркировки подход и методы количественного анализа связывания.

ReAsH / Flash Маркировка и анализ изображений белков Tetracysteine ​​датчика в клетках

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Робототехника и динамического анализа изображения для исследования экспрессии генов в тканях растений

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Исследование конформационной динамики мембранных белков На месте С Сайт-направленный флуоресцентная маркировка

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Автоматизированный анализ динамических Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в последовательности изображений

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Последовательность конкретных Маркировка нуклеиновых кислот и белков с метилтрансферазы и кофактора аналогов

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Иммунофлуоресценции Анализ эндогенные и экзогенные Центромера-кинетохор Белки

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Анализы для деградации неправильно свернутых белков в клетках

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Иммунофлюоресцентная маркировка белков вирусов растений и насекомых-векторов в полужесткокрылых кишках

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

ReAsH / Flash Маркировка и анализ изображений белков Tetracysteine ​​датчика в клетках

ReAsH / Flash Маркировка и анализ изображений белков Tetracysteine датчика в клетках