Name: competitive genomic screens of barcoded yeast libraries
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

نشكر رون ديفيس ، Deutschbauer آدم ، والهيب هوب بأكمله مختبر في جامعة تورونتو للمناقشات والمشورة. CN معتمد من المنح المقدمة من المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشرية (رقم المنحة HG000205) ، RO1 HG003317 ، CIHR MOP - 84305 ، والجمعية الكندية للسرطان (# 020380). كان مدعوما من قبل JO التدريب ستانفورد برنامج الجينوم (المنحة رقم T32 HG00044 من المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشرية) ، والمعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم P01 GH000205). معتمد من قبل GG HG003317 RO1 NHGRI وجمعية السرطان الكندية ، وغرانت # 020380 ، TD وتسلسل دونيلي مركز معتمد في جزء من المنح المقدمة من المؤسسة الكندية للإبداع إلى الدكاترة. بريندا اندروز جرينبلات وجاك. معتمد من قبل هيئة علماء المسلمين في جامعة تورنتو زمالة فتح.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome.">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile.">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling:+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast.">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li><li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing.">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li><li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هنا ، حددت لدينا بروتوكول ، مع التعديل متواضعة ، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع مجموعة واسعة من مجموعات القائمة من مجموعات متحولة barcoded من الكائنات الحية الدقيقة المختلفة لإنشاء مجموعات متحولة المفتاحية. فإننا نؤكد أنه على الرغم من أننا قد أبلغت بروتوكولا حول الطفرات ينقول المفتاحية للالخميرة الممرضة C. يمكن albicans ، يمكن تكييفها على بروتوكول مشابهة جدا لمجموعة واسعة من الفطريات وحيدة الخلية. تعديل هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد في البكتيريا 13 ، ومجموعات حاليا لعدد من العوامل الوراثية إضافية الفطرية والبكتيرية هي قيد الانشاء. في الوقت الحاضر ، يوفر هذا الاختبار الشامل فقط ، الجينوم على نطاق الشاشة غير منحازة للتفاعل الجينات جزيء صغير. ميزة واحدة مقنعة خاصة للمقايسة هو أن هناك حاجة إلى المعرفة المسبقة للجينات أو جزيء صغير. على الرغم من نطاق وقوة هذه المقايسات ، وعرقل نقلها إلى مختبرات أخرى إلى حد ما من الاستثمارات الرأسمالية الأولية والأدوات المعلوماتية لتحليل النتائج. مع اعتماد قراءة تسلسل الجيل المقبل جنبا إلى جنب مع أدوات قوية لتحليل ، فإننا نتوقع زيادة اعتمادها.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المضادات الحيوية </td><td> البائعين وأرقام التسويقي </td></tr><tr><td> كربنيسيلين </td><td> سيغما ، الجزء # C1613 </td></tr><tr><td> الكاناميسين </td><td> سيغما ، الجزء # K1876 </td></tr><tr><td> سبكتينوميسين </td><td> سيغما ، الجزء # S0692 </td></tr><tr><td> الكلورامفينيكول </td><td> سيغما ، الجزء # C0378 </td></tr><tr><td> الحمض النووي تنظيف ومجموعات التركيز </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep سبين Miniprep كيت </td><td> Qiagen ، الجزء # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​كيت ماكسي البلازميد </td><td> Qiagen ، الجزء # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick أدوات تنقية PCR </td><td> Qiagen ، الجزء # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick جل استخراج كيت </td><td> Qiagen ، الجزء # 28704 </td></tr><tr><td> PCR والكواشف الكهربائي </td><td></td></tr><tr><td> طق الحمض النووي بوليميريز (ميغاغرام مجانا) العازلة </td><td> نيو إنجلاند Biolabs ، الجزء # M0320L </td></tr><tr><td> Deoxynucleotide الحل ميكس </td><td> نيو إنجلاند Biolabs ، الجزء # N0447L </td></tr><tr><td> 25 ملم MgCl 2 </td><td> سيغما ، الجزء # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose ، صبغ التحميل ، والحمض النووي وصمة عار مناسبة للهلام إستشراد </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> 10X تاي العازلة </td><td> سيغما ، الجزء # T8280 </td></tr><tr><td> 1 كيلوبايت زائد سلم DNA </td><td> Invitrogen ، الجزء # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD مرق </td><td></td></tr><tr><td> 10 غراما من خلاصة الخميرة </td><td> سيغما ، الجزء # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 غراما Bacto ببتون </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني ، وهي جزء # 211677 </td></tr><tr><td> 20 غرام من سكر العنب </td><td> سيغما ، الجزء # D9434 </td></tr><tr><td> ابوار </td><td></td></tr><tr><td> ماصات الأقنية (1000 ، 200 ، وميكرولتر 20) </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> المتاح الخزانات pipetting </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> 15 و 50 مل من أنابيب الطرد المركزي </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> 96 -- و384 بئر عميقة لوحات حسنا </td><td> Axygen العلمية ، الجزء # P - SQ - 2ML - CS &amp; P - 384240SQCS </td></tr><tr><td> 96 - جيدا و 384 جيدا لوحات PCR وفيلم الختم </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> الأسطوانة لوحة لوحات متعددة جيدا الختم </td><td> سيغما ، الجزء # R1275 </td></tr><tr><td> 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية تهز حاضنات لنمو البكتيريا والخميرة وعلى لوحات في أنابيب </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> الطفرات في المختبر ينقول </td><td></td></tr><tr><td> EZ - Tn5 Transposase </td><td> Epicentre الحيوية ، الجزء # TNP92110 </td></tr><tr><td> الإنتاجية العالية التحول </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT طقم الإعدادية البلازميد </td><td> حافة النظم البيولوجية ، الجزء # 84359 </td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول ، الوزن الجزيئي 3350 </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> خلات ليثيوم </td><td> سيغما ، الجزء # 517992 </td></tr><tr><td> 6 كذلك لوحات ، ومعقمة </td><td> كورنينج ، الجزء # 3335 </td></tr><tr><td> 50 ملغ / مل يوريدين </td><td> سيغما ، الجزء # U3750 </td></tr><tr><td> 100X حل العازلة تريس - EDTA </td><td> سيغما ، الجزء # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> السلمون خصية DNA </td><td> سيغما ، الجزء # 1626 </td></tr><tr><td> نمو مجموعات barcoded </td><td></td></tr><tr><td> 48 لوحات جيدة ، وإذا تزايد الثقافات في لوحات </td><td> غرينر ، الجزء # M9437 </td></tr><tr><td> لوحة الأختام لاصقة </td><td> ABgene ، الجزء # AB - 0580 </td></tr><tr><td> 200 مل ثقافة القوارير </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> قادرة على امتصاص الطيف الضوئي </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> درجة الحرارة التي تسيطر عليها شاكر ل 250 مل أو قوارير معمل الهز </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> آمن قفل أنبوب Microcentrifuge ، 2 مل </td><td> إيبندورف ، الجزء # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> التهجين المعدات </td><td></td></tr><tr><td> فرن التهجين 640 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip Fluidic محطة 450 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray ماسح 3000 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 00-0212 </td></tr><tr><td> حمام ماء يغلي مع رف العائمة </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> التهجين الاستهلاكية </td><td></td></tr><tr><td> Genflex صفيف 16K العلامات V2 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 511331 </td></tr><tr><td> دينهارت في الحل ، والتركيز 50X </td><td> سيغما ، الجزء # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin ، R - فيكوإيريترين المتقارن (SAPE) </td><td> Invitrogen ، الجزء # S866 </td></tr><tr><td> آمن قفل أنبوب Microcentrifuge ، و 0.5 مل </td><td> إيبندورف ، الجزء # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> صغير صارم البقع </td><td> تنوعا في مجال التكنولوجيا الحيوية ، الجزء # LTTM - 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> BioRad ، الجزء # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10 ٪ توين </td><td> سيغما ، الجزء # T2700 </td></tr><tr><td> MES مونوهيدرات حامض مجانا </td><td> سيغما ، الجزء # M5287 </td></tr><tr><td> MES الصوديوم الملح </td><td> سيغما ، الجزء # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما ، الجزء # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> سيغما ، الجزء # S2015 </td></tr><tr><td> البيولوجيا الجزيئية المياه الصف </td><td> سيجما ، الجزء # W4502 </td></tr><tr><td> التهجين الاشعال </td><td> مختلف الموردين (تحلية قياسي) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;البيوتين GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;البيوتين GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;البيوتين CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> التسلسل الاشعال : منهاج البورشيد </td><td> مختلف الموردين </td></tr><tr><td> UpTag الأمام (100uM) </td><td> 5 &#39;GCA CAA GAA GAC GGC ATA GCT CTT CGA CCG ATC T GAG CAC GTC GAT GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag عكسي (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG فريق التنسيق العالمي ACC ACC TCC CTT GAC ACT CTA CAC CCG GAC GCT CTT ATC T NNNNN GAC GTC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag الأمام (100uM) </td><td> 5 &#39;GCA CAA GAA GAC GGC ATA GCT CTT CGA CCG AAC GAG ATC T CTC GAA GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag عكسي (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG فريق التنسيق العالمي ACC ACC TCC CTT GAC ACT CTA CAC CCG GAC GCT CTT ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3` </td></tr><tr><td> قراءة UP - 1 علامة التمهيدي وما يليها (100uM) </td><td> 5 &#39;GAC GTC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> 1 وما يليها قراءة التمهيدي أسفل علامة (100uM) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> 2 قراءة تسلسل مؤشر التمهيدي (معيار التمهيدي البورشيد R1) (100uM) </td><td> 5 &#39;ACT AC CTT TCC CTA CAC CCG GAC GCT CTT ATC تي 3&quot; </td></tr><tr><td> الكواشف تسلسل إضافية / معدات </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF أدوات تنقية PCR </td><td> Qiagen ، الجزء # 29051 </td></tr><tr><td> فراغ مضخة </td><td> أي بائع </td></tr><tr><td> Macherey - ناجل فراغ المنوع </td><td> Macherey ، ناجل ، الجزء # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen كوانت BR - IT dsDNA الفحص كيت </td><td> Invitrogen ، الجزء # Q32853 </td></tr><tr><td> أنابيب Invitrogen و qubit مقايسة </td><td> Invitrogen ، الجزء # Q32856 </td></tr><tr><td> 40 ٪ زائد الأكريلاميد N 1 ٪ ، N&#39; - الميثيلين مكرر الأكريلاميد ، 37.5:1 </td><td> بيو راد ، الجزء # 161-0148 </td></tr><tr><td> قاعدة تريس </td><td> سيغما ، الجزء # T1503 - 1KG </td></tr><tr><td> حمض البوريك </td><td> سيغما ، الجزء # B6768 - 500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> Teknova ، الجزء # E0306 </td></tr><tr><td> الأمونيوم بيرسلفات </td><td> سيغما ، الجزء # A3678 - 25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop ، الجزء # TEM001.25 </td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد الحل </td><td> Bioshop ، الجزء # ETB444.10 </td></tr><tr><td> خلات الأمونيوم 0.5M </td><td> Teknova ، الجزء # A2000 </td></tr><tr><td> 10MM tetrahydrate المغنيسيوم خلات </td><td> سيغما ، الجزء # M0631 - 100G </td></tr><tr><td> 1MM EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> انظر 0.5M EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> خلات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.2 </td><td> Teknova ، الجزء # S0297 </td></tr><tr><td> سرعة فراغ </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> واحدة للقراءة مجموعة الكتلة الجيل </td><td> البورشيد ، الجزء # GD - 300 - 1001 </td></tr><tr><td> 36C تسلسل مجموعة V4 </td><td>البورشيد ، الجزء # FC - 104 - 4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBE صفة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المبالغ </td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> 108 غرام </td><td> قاعدة تريس </td></tr><tr><td> 55 غراما </td><td> حمض البوريك </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> 0.5M EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) </td></tr><tr><td colspan="2"> إضافة درهم 2 O للاحتفال 1L </td></tr></tbody></table> 12 ٪ هلام بولي أكريلاميد صفة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مجلدات </td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> 5.8 مل </td><td> 40 ٪ زائد الأكريلاميد N 1 ٪ ، N&#39; - الميثيلين مكرر الأكريلاميد ، 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 مل </td><td> DH 2 O </td></tr><tr><td> 2 مل </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 ميكرولتر </td><td> 10 ٪ الأمونيوم بيرسلفات </td></tr><tr><td> اجمالى حجم : 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag مزيج التمهيدي : Resuspend Uptag وBuptagkanmx4 في كل DDH 2 O عند 100 ميكرومتر ، ثم في مزيج نسبة 1:1 لتركيز النهائي من 50 ميكرومتر لكل منهما. المحل في -20 درجة مئوية. Downtag مزيج التمهيدي : Resuspend Dntag وBdntagkanmx4 في كل DDH 2 O عند 100 ميكرومتر ، ثم في مزيج نسبة 1:1 لتركيز النهائي من 50 ميكرومتر لكل منهما. المحل في -20 درجة مئوية. [أليغنوكليوتيد] مختلطة : Resuspend كل من oligos الثمانية التالية (معيار المحلاة) في DDH 2 O عند 100 ميكرومتر : Uptag ، Dntag ، Uptagkanmx ، Dntagkanmx ، Uptagcomp ، Dntagcomp ، Upkancomp ، Dnkancomp. مزيج حجم مساو من [أليغنوكليوتيد] ثمانية لتركيز النهائي من 12.5 ميكرومتر لكل منهما. 12X زارة التربية والعلم المخزون : لمدة 10 مل ، ويحل 0،7 ز MES مونوهيدرات حامض الحرة والصوديوم 1.93 غ من الملح زارة التربية والعلم في 8 مل البيولوجيا الجزيئية المياه الصف. بعد مزجها جيدا ، والتحقق من ضبط درجة الحموضة وإذا دعت الحاجة إلى 6،5-6،7 درجة الحموضة. يضاف الماء إلى وحدة تخزين ما مجموعه 10 مل. فلتر تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء (على سبيل المثال ، التفاف الأنبوب في احباط). إذا حل محل يصبح أصفر واضح أو بعد 6 أشهر. 2X تهجين العازلة : لمدة 50 مل ، ومزيج من 8.3 مل 12X زارة التربية والعلم المخزون (من 2.9.14) ، 17.7 مل من كلوريد الصوديوم M 5 ، 4.0 مل من EDTA M 0.5 ، 0.1 مل من 10 ٪ توين 20 (المجلد / المجلد) ، و 19.9 مل تصفيتها DDH 2 O. فلتر تعقيم. غسل ج : ميكس 300 مل 20X SSPE ، 1 مل توين 10 ٪ (المجلد / المجلد) ، 699 مل DDH 2 O. فلتر تعقيم. يغسل ب : ميكس 150 مل 20X SSPE ، 1 مل توين 10 ٪ (المجلد / المجلد) و 849 مل DDH 2 O. فلتر تعقيم. الاشعال الباركود التسلسل في متواليات التمهيدي UP - علامة ذيل 5 &#39;(جريئة) ومحول البورشيد متواليات محددة تدمج التمهيدي F و R. تسلسل متغير (مائل) يمثل علامة الفهرسة 5 مير المستخدمة في مضاعفة / مؤشر إلى القراءة. الذيل 3 &#39;(تحتها خط) يمثل التمهيدي مشتركة تطوق الباركود uptag ومطلوب لتضخيم الباركود الخميرة. في علامة - DOWN التمهيدي تسلسل 5 &#39;الذيل مطابقة لل5&#39; ذيل UP - العلامة الاشعال (تسلسل معين البورشيد) ، ومع ذلك ، يتم استبدال الذيل 3 &#39;(تحتها خط) مع الاشعال الشائعة التي تستخدم لتضخيم - DOWN علامة الباركود.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

بفضل التقدم في تقنيات الجيل القادم التسلسل ، علينا الوصول إلى تسلسل الجينوم جديدة يوميا تقريبا. وتيرة هذا التقدم يتسارع ، واعدا بمزيد من العمق والاتساع. في ضوء هذه التطورات غير العادية ، والحاجة إلى أساليب وسريع مواز لتحديد وظيفة الجين يصبح أكثر أهمية من أي وقت مضى. مجموعة من المسوخ الحذف الجينوم واسعة في الخمائر وهاء. القولونية كانت بمثابة حقوله المنتجة لتوصيف وظيفي لوظيفة الجينات ، ولكن هذا النهج ليس للتحجيم ، حذف الحالي الجينات النهج يتطلب كل واحد من آلاف الجينات التي تشكل الجينوم المراد حذفه والتحقق منها. يمكن فقط بعد اكتمال هذا العمل نسعى عالية الإنتاجية phenotyping. على مدى العقد الماضي ، وحسنت مختبرنا مجموعة من المنافسة ، المنمنمة الجينوم على نطاق عالية الإنتاجية ، المقايسات التي يمكن القيام بها بشكل متواز. هذه الموازاة ممكن لأن لإدراج &#39;علامات&#39; الحمض النووي ، أو &quot;الباركود&quot; في كل متحولة ، مع الباركود بمثابة وكيل لطفرة واحدة ويمكن قياس وفرة الباركود لتقييم اللياقة البدنية متحولة. في هذه الدراسة ، ونحن نسعى لملء الفجوة بين تسلسل الحمض النووي ومجموعات متحولة barcoded. لإنجاز هذا نقدم مجتمعة ينقول تعطل - المتوازية النهج الذي يفتح المقايسات الباركود موازية لمتسلسلة حديثا ، ولكن تتميز سيئة الميكروبات. لتوضيح هذا النهج الذي يقدم مجموعة جديدة المبيضات البيض تعطل barcoded وتصف كيف يمكن استخدام كلا ميكروأري القاعدة والجيل القادم التسلسل المنصات المرتكزة إلى جمع 10000 -- 1000000 الجينات الوراثية والجينات المخدرات التفاعلات في تجربة واحدة.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

تظاهرة فنية من الجامعة التهجين الجينومي المقارن صفيف الجينوم

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Yeast Colony Embedding Method

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

الجينومية التحول من Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...