Name: competitive genomic screens of barcoded yeast libraries
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00
Duration: 11 min 59 s
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我们感谢罗恩戴维斯，亚当Deutschbauer，整个臀部在多伦多大学的讨论和意见的跳实验室。 CN是由国家人类基因组研究所（批准号HG000205），RO1 HG003317，CIHR澳门币84305，加拿大癌症协会（＃020380）的赠款支持。联办是由斯坦福大学的基因组培训计划（批准数的T32 HG00044从国家人类基因组研究所）和国立卫生研究院（批准号P01 GH000205）支持。 GG是在NHGRI RO1 HG003317和加拿大癌症协会，格兰特＃020380，运输署和唐纳利测序中心的支持，部分是从加拿大创新到DRS基金会的赠款支持。布兰达安德鲁斯和杰克布拉特。 AMS是由多伦多大学打开奖学金支持。

<ol>
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没有利益冲突的声明。

在这里，我们提出了一个协议，适度的修改，可以很容易地适应广泛的现有馆藏的创建标签突变馆藏的条形码不同的微生物突变集合。我们强调，虽然我们已经报道了标签的转座子突变致病性酵母菌 C.一个协议白色念珠菌 ，一个非常类似的协议，可以适应各种各样的单细胞真菌。修改，该协议运作良好13中的细菌，和目前正在建设中一些额外的真菌和细菌的基因组的集合。目前，这个实验提供了唯一的综合性，全基因组基因的小分子的相互作用的公正屏幕。其中特别引人注目的检测功能是没有的基因或小分子的先验知识是必需的。尽管这些检测的范围和权力，其可转让给其他实验室已经有点阻碍，由最初的资本投资和信息工具，分析的结果。通过结合分析的强大工具的下一代序列读数，我们期望通过增加。

<table border="1"><tbody><tr><td> 抗生素 </td><td> 供应商和产品目录号</td></tr><tr><td>羧</td><td> Sigma公司的一部分＃C1613 </td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td> Sigma公司的一部分＃K1876 </td></tr><tr><td>大观</td><td> Sigma公司的一部分＃S0692 </td></tr><tr><td>氯霉素</td><td> Sigma公司的一部分＃C0378 </td></tr><tr><td> 清理和浓度试剂盒的DNA </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep自旋小量制备试剂盒</td><td> Qiagen公司，部分＃27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed​​质粒马克西套件</td><td> Qiagen公司，部分＃12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR纯化试剂盒</td><td> Qiagen公司，部分＃28106 </td></tr><tr><td> QIAquick凝胶提取试剂盒</td><td> Qiagen公司，部分＃28704 </td></tr><tr><td> PCR和电泳试剂 </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA聚合酶（MG -免费）缓冲区</td><td> New England Biolabs公司的一部分，＃M0320L </td></tr><tr><td>脱氧核苷酸的解决方案组合</td><td> New England Biolabs公司的一部分，＃N0447L </td></tr><tr><td> 25毫米氯化镁2 </td><td>西格玛，部分＃63036 </td></tr><tr><td>琼脂糖，装载染料，核酸染色适用于凝胶电泳</td><td>各种</td></tr><tr><td> 10X TAE缓冲液</td><td> Sigma公司的一部分＃T8280 </td></tr><tr><td> 1 KB PLUS DNA梯状</td><td> Invitrogen公司的一部分＃10787026 </td></tr><tr><td> YPD肉汤 </td><td></td></tr><tr><td> 10克酵母提取物</td><td> Sigma公司的一部分＃Y1625 </td></tr><tr><td>细菌用胰蛋白胨20克</td><td> BD公司的一部分，＃211677 </td></tr><tr><td> 20克的葡萄糖</td><td> Sigma公司的一部分＃D9434 </td></tr><tr><td> 医学实验 </td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（1000，200，和20μL） </td><td>各种</td></tr><tr><td>一次性移液器水库</td><td>各种</td></tr><tr><td> 15日和50 mL离心管</td><td>各种</td></tr><tr><td> 96 - 384孔深井板</td><td>爱思进科学，一部分的P - 2ML - SQ - CS＆P - 384240SQCS </td></tr><tr><td> 96孔和384孔PCR板和密封膜</td><td>各种</td></tr><tr><td>版辊密封多孔板</td><td> Sigma公司的一部分＃R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C和37 ° C摇晃增长的平板上的细菌和酵母和孵化器在管</td><td>各种</td></tr><tr><td> 在体外转座子诱变 </td><td></td></tr><tr><td> EZ - Tn5的转座子</td><td>震中生物技术的一部分，＃TNP92110 </td></tr><tr><td> 高通量转型 </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT质粒准备工具包</td><td>边缘生物系统公司的一部分，＃84359 </td></tr><tr><td>聚乙二醇，分子量3350 </td><td>各种</td></tr><tr><td>醋酸锂</td><td> Sigma公司的一部分＃517992 </td></tr><tr><td> 6孔板，无菌</td><td>康宁，部分＃3335 </td></tr><tr><td> 50毫克/毫升尿苷</td><td> Sigma公司的一部分＃U3750 </td></tr><tr><td> 100X的Tris - EDTA缓冲液</td><td> Sigma公司的一部分＃T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td>各种</td></tr><tr><td>鲑鱼睾丸DNA </td><td> Sigma公司的一部分＃1626 </td></tr><tr><td> 增长的条形码集合 </td><td></td></tr><tr><td> 48孔板;如果增长板中的文化</td><td>格雷纳，部分＃M9437 </td></tr><tr><td>胶粘板密封</td><td> ABgene，部分＃AB - 0580 </td></tr><tr><td> 200毫升的培养瓶中</td><td>各种</td></tr><tr><td>能够分光光度计吸光度</td><td>各种</td></tr><tr><td>控温摇床，250毫升烧瓶或晃动分光光度计</td><td>各种</td></tr><tr><td>安全锁的离心管中，2毫升</td><td> Eppendorf公司的一部分，0030 120.094 </td></tr><tr><td> 杂交设备 </td><td></td></tr><tr><td>杂交炉640 </td><td> Affymetrix公司的一部分＃800138 </td></tr><tr><td>基因芯片流体站450 </td><td> Affymetrix公司，部分＃00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray扫描仪3000 </td><td> Affymetrix公司，部分＃00-0212 </td></tr><tr><td>沸水浴浮动机架</td><td>各种</td></tr><tr><td> 杂交耗材 </td><td></td></tr><tr><td> Genflex标签16K阵列V2 </td><td> Affymetrix，一部分＃511331 </td></tr><tr><td>登哈特的解决方案，集中50X </td><td> Sigma公司的一部分＃D2532 </td></tr><tr><td>链霉亲和，R -藻红蛋白共轭（萨佩） </td><td> Invitrogen公司的一部分＃S866 </td></tr><tr><td>安全锁的离心管，0.5毫升</td><td> Eppendorf公司的一部分，0030 123.301 </td></tr><tr><td>蝇头强硬点</td><td>多样化的生物技术，部分＃LTTM - 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> BioRad公司，部分＃161-0729 </td></tr><tr><td> 10％吐温</td><td> Sigma公司的一部分＃T2700 </td></tr><tr><td> MES的自由酸水合物</td><td> Sigma公司的一部分＃M5287 </td></tr><tr><td> MES钠盐</td><td> Sigma公司的一部分＃M5057 </td></tr><tr><td> 5 M氯化钠</td><td>西格玛，部分＃71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma公司的一部分＃S2015 </td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td> Sigma公司的一部分＃W4502 </td></tr><tr><td> 杂交引物 </td><td> 各供应商（标准除盐） </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5&#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5&#39;生物素GTCGACCTGCAGCGTACG 3 </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5&#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5&#39;生物素GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5&#39;生物素CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3 </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5&#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3“ </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3“ </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3“ </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3“ </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3“ </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3“ </td></tr><tr><td> 测序引物：Illumina公司平台 </td><td> 各供应商 </td></tr><tr><td> UpTag远期（100um的） </td><td> GGC GAC的阿拉木图5“民航局GCA GAA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC的大老山隧道3” </td></tr><tr><td> UpTag反向（100um的） </td><td> GCG ACG的行政协调会5“学能测验的GAT ACC GAC中的ACT铁通台泥税务师CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG总工会ACG的3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag远期（100um的） </td><td> GGC GAC的阿拉木图 5“ 民航局GCA GAA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC聚糖反恐委员会GAA TTC ATC地下3” </td></tr><tr><td> DownTag反向（100um的） </td><td> GCG ACG的行政协调会 5“ 学能测验的GAT ACC GAC中的ACT铁通台泥税务师CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG公司的TGT CGG大老山隧道总工会公司3` </td></tr><tr><td>阅读1标签SEQ引物（100um的） </td><td> 5&#39;GTC GAC CTG C​​AG总工会ACG的3&#39; </td></tr><tr><td>阅读1下标签SEQ引物（100um的） </td><td> CGG公司的TGT CGG大老山隧道CGT公司5&#39;3&#39; </td></tr><tr><td>阅读指数测序引物（标准Illumina的R1底漆）（100um的） </td><td> 5“交流使铁通台泥税务师CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3” </td></tr><tr><td> 更多的测序试剂/设备</td><td></td></tr><tr><td> Qiagen公司MinElute 96 UF PCR纯化试剂盒</td><td> Qiagen公司，部分＃29051 </td></tr><tr><td>真空泵</td><td>任何供应商</td></tr><tr><td>马歇雷-纳格尔真空歧管</td><td>马歇雷纳格尔，部分＃740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen公司QUANT它双链BR检测试剂盒</td><td> Invitrogen公司的一部分＃Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen公司的量子位的检测管</td><td> Invitrogen公司的一部分＃Q32856 </td></tr><tr><td>丙烯酰胺40％加1％N，N&#39; -亚甲基双丙烯酰胺，37.5:1 </td><td>生物RAD，部分＃161-0148 </td></tr><tr><td>三基地</td><td> Sigma公司的一部分＃T1503 - 1KG </td></tr><tr><td>硼酸</td><td> Sigma公司的一部分＃B6768 - 500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA，pH值8.0 </td><td> Teknova，部分＃E0306 </td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td> Sigma公司的一部分＃A3678 - 25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop，部分＃TEM001.25 </td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液</td><td> Bioshop，部分＃ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0.5M铵酯</td><td> Teknova，部分＃A2000 </td></tr><tr><td> 10MM镁醋酸水合物</td><td> Sigma公司的一部分＃M0631 - 100G </td></tr><tr><td>为1mM EDTA，pH值8.0 </td><td> 0.5M EDTA，pH值8.0 </td></tr><tr><td>乙醇</td><td>各种</td></tr><tr><td>醋酸钠，pH值5.2 </td><td> Teknova，部分＃S0297 </td></tr><tr><td>高速真空</td><td>各种</td></tr><tr><td>单读集群生成工具包</td><td> Illumina公司的一部分，GD - 300 - 1001 </td></tr><tr><td> 36C测序试剂盒V4 </td><td>Illumina公司，部分FC - 104 - 4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBE缓冲液配方<table border="1"><tbody><tr><td>应收</td><td>试剂</td></tr><tr><td> 108克</td><td>三基地</td></tr><tr><td> 55克</td><td>硼酸</td></tr><tr><td> 40ML </td><td> 0.5M EDTA（pH值8.0） </td></tr><tr><td colspan="2"> DH 2 O至1L标志</td></tr></tbody></table> 12％的聚丙烯酰胺凝胶配方<table border="1"><tbody><tr><td>卷</td><td>试剂</td></tr><tr><td> 5.8毫升</td><td>丙烯酰胺40％加1％N，N&#39; -亚甲基双丙烯酰胺，37.5:1 </td></tr><tr><td> 12毫升</td><td> DH 2 O </td></tr><tr><td> 2毫升</td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140μL </td><td> 10％过硫酸铵</td></tr><tr><td>总成交量：20毫升</td><td></td></tr></tbody></table> Uptag引物组合： 悬浮Uptag Buptagkanmx4在DDH 2 O的每100微米，然后以1:1的比例混合，终浓度为50微米。储存在-20 ° C。 Downtag引物组合： 悬浮Dntag Bdntagkanmx4 DDH 2 O在100微米，然后以1:1的比例混合，终浓度为50微米。储存在-20 ° C。 混合寡核苷酸： 重悬在DDH 2 O在100微米以下八个寡核苷酸（标准脱盐）： Uptag，Dntag，Uptagkanmx，Dntagkanmx，Uptagcomp，Dntagcomp，Upkancomp，Dnkancomp。 混合同等体积的八个寡核苷酸终浓度为12.5μM。 12X MES的股票： 10毫升，0.7克的MES游离酸水合物和1.93克MES钠盐溶于8毫升分子生物学级水。搅拌好后，检查pH值和调整，如果需要的话pH值6.5-6.7。加水到10毫升的总量。过滤消毒，并保存在4 ° C的光（例如，包装箔管）保护。替换，如果溶液变成明显的黄色或6个月后。 2X杂交缓冲液： 对于50毫升，混合12X MES的股票（从14年9月2日）8.3毫升，17.7毫升5 M氯化钠，4.0毫升的0.5 M EDTA，0.1毫升10％的吐温20（体积/体积），19.9毫升，过滤DDH 2 O。过滤消毒。 洗了：混合300毫升20X SSPE，1 mL 10％的吐温（体积/体积），699毫升DDH 2 O。过滤消毒。 洗净乙：混合150毫升20X SSPE，1 mL 10％的吐温（体积/体积），849毫升DDH 2 O过滤消毒。 条码测序引物 -标记引物序列的5&#39;尾巴（ 粗体 ）Illumina的特定适配器纳入F和R引物序列。变量序列（ 斜体字 ）5 MER索引标签，用于在复用/索引读出。 3&#39;尾巴（下划线）代表的共同引物侧翼uptag条码，需要放大酵母条码。 下调标记的引物序列5&#39;尾巴是相同的5&#39;UP标记的引物（Illumina的具体序列）的尾巴，然而，3&#39;尾巴（下划线）所使用的共同引物扩增取代向下标签条形码。

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

凭借在新一代测序技术的进步，我们几乎每天都获得新的基因组序列。这些进步的步伐正在加快，前途更大的深度和广度。鉴于这些非凡的进步，需要快速，并行的方法，以确定基因功能变得更加重要。集合的全基因组的缺失突变体， 酵母菌和大肠杆菌大肠杆菌曾担任基因功能的功能特性的工作母机，但这种方法是不可伸缩的，目前的基因缺失方法要求每个成千上万的基因组成基因组中被删除，并核实的。只有这项工作完成后，我们可以追求高通量的表型。在过去的十年，我们的实验室已提炼组合的竞争力，小型化，高通量的基因组范围内，可并行执行检测。这是可能的并行，因为DNA“标签”，或“条码”，到每个突变列入，条形码突变的代理服务和一个可以衡量条码丰评估突变体健身。在这项研究中，我们设法填补DNA序列和条形码突变集合之间的差距。而要做到这一点，我们引入一个结合转座子中断条码的方法，开辟了并行条码检测新测序，但较差的特点微生物。为了说明这种方法，我们提出一个新的白色念珠菌条形码中断收集和描述如何将两个芯片为基础的下一代测序为基础的平台，可以用来收集万- 100万在一次实验中基因-基因和基因药物的相互作用。

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

我们已经开发出全面的，无偏见的全基因组的屏幕，了解基因药物和基因与环境的相互作用。筛选这些突变集合的方法。

条形码酵母图书馆竞争力的基因屏幕

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

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