Name: competitive genomic screens of barcoded yeast libraries
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

We danken Ron Davis, Adam Deutschbauer, en de hele HIP HOP laboratorium aan de Universiteit van Toronto voor discussies en advies. CN wordt ondersteund door subsidies van de National Human Genome Research Institute (Grant Number HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, en de Canadese Cancer Society (# 020380). JO werd gesteund door de Stanford Genome Training Program (Grant Aantal T32 HG00044 van de National Human Genome Research Institute) en de National Institutes of Health (Grant Number P01 GH000205). GG wordt ondersteund door de NHGRI RO1 HG003317 en de Canadese Cancer Society, Grant # 020380, TD en de Donnelly Sequencing Centre wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Canadese Stichting voor Innovatie aan Drs. Brenda Andrews en Jack Greenblatt. AMS wordt ondersteund door een universiteit van Toronto Open Fellowship.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome.">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile.">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling:+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast.">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li><li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing.">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li><li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hier hebben we aangegeven een protocol dat, met een bescheiden wijziging, gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala van bestaande collecties van de barcode mutant verzamelingen van verschillende micro-organismen om gecodeerde mutant collecties aan te maken. We benadrukken dat terwijl we hebben gemeld een protocol over de gelabelde transposon mutagenese voor de pathogene gist C. albicans, een zeer gelijkaardig protocol kan worden aangepast aan een breed scala van eencellige schimmels. Gewijzigd, dit protocol werkt goed in bacteriën 13, en momenteel collecties voor een aantal extra schimmel-en bacteriële genoom van zijn in aanbouw. Op dit moment is deze test biedt de enige uitgebreide, genoom-brede onpartijdige scherm voor gen-kleine molecule interacties. Een bijzonder aantrekkelijke eigenschap van de test is dat er geen voorkennis van het gen of kleine molecule is vereist. Despite de omvang en kracht van deze testen, is hun overdraagbaarheid naar andere laboratoria werden enigszins gehinderd door de investering en de informatica-instrumenten voor de analyse van de resultaten. Met de goedkeuring van een volgende generatie opeenvolging uitlezing in combinatie met krachtige tools voor analyse, verwachten we de goedkeuring ervan te verhogen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotica </td><td> Verkoper en catalogusnummers </td></tr><tr><td> Carbenicilline </td><td> Sigma, part # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Sigma, part # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomycine </td><td> Sigma, part # S0692 </td></tr><tr><td> Chlooramfenicol </td><td> Sigma, part # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Clean-up en concentratie kits </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 28704 </td></tr><tr><td> PCR en electroforese reagentia </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA-polymerase (Mg-vrij) Buffer </td><td> New England Biolabs, part # M0320L </td></tr><tr><td> Deoxynucleotide oplossing te mengen </td><td> New England Biolabs, part # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, part # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, laden kleurstof, en nucleïnezuur vlek die geschikt zijn voor gel-elektroforese </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> 10X TAE buffer </td><td> Sigma, part # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Plus DNA Ladder </td><td> Invitrogen, part # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD bouillon </td><td></td></tr><tr><td> 10 g gistextract </td><td> Sigma, part # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto pepton </td><td> BD Biosciences, part # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g dextrose </td><td> Sigma, part # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> Meerkanaalspipetten (1000, 200, en 20 pi) </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Wegwerp pipetteren reservoirs </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> 15 en 50 ml centrifugebuizen </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> 96 - en 384-Well Deep Well Platen </td><td> Axygen Scientific, part # P-2 ml-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-well-en 384-wells PCR-platen en afdichting film </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Plaat roller voor het afdichten van multi-well platen </td><td> Sigma, part # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C en 37 ° C schudden incubators voor het kweken van bacteriën en gist op platen en in tubes </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> In vitro transposon mutagenese </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 transposase </td><td> Epicentre Biotechnologie, part # TNP92110 </td></tr><tr><td> High-throughput transformatie </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit </td><td> Edge Biosystems, onderdeel # 84359 </td></tr><tr><td> polyethyleenglycol, moleculair gewicht 3350 </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> lithium-acetaat </td><td> Sigma, part # 517992 </td></tr><tr><td> 6-well platen, steriel </td><td> Corning, part # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml uridine </td><td> Sigma, part # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA-buffer-oplossing </td><td> Sigma, part # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> zalm testis DNA </td><td> Sigma, part # 1626 </td></tr><tr><td> Groei van de barcode collecties </td><td></td></tr><tr><td> 48-wells-platen, als de groei culturen in platen </td><td> Greiner, part # M9437 </td></tr><tr><td> Zelfklevende plaat afdichtingen </td><td> ABgene, part # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 ml cultuur flessen </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Spectrofotometer waarmee absorptie </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Temperatuur-gecontroleerde shaker voor 250 ml flesjes of schudden spectrofotometer </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Safe-Lock microcentrifugebuis, 2 mL </td><td> Eppendorf, part # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hybridisatie apparatuur </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisatie Oven 640 </td><td> Affymetrix, part # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip fluïde Station 450 </td><td> Affymetrix, part # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, part # 00-0212 </td></tr><tr><td> Bad met kokend water met drijvende rek </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Hybridisatie verbruiksartikelen </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag 16K Array v2 </td><td> Affymetrix, part # 511331 </td></tr><tr><td> Denhardt&#39;s Solution, 50x concentreren </td><td> Sigma, part # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidine, R-phycoerythrin conjugaat (SAPE) </td><td> Invitrogen, part # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock microcentrifugebuis, 0,5 ml </td><td> Eppendorf, part # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, part # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, part # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, part # T2700 </td></tr><tr><td> MES vrij zuur monohydraat </td><td> Sigma, part # M5287 </td></tr><tr><td> MES natriumzout </td><td> Sigma, part # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, part # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, part # S2015 </td></tr><tr><td> Moleculaire biologie kwaliteit water </td><td> Sigma, part # W4502 </td></tr><tr><td> Hybridisatie Primers </td><td> Verschillende leveranciers (standaard ontzouten) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotine-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotine-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotine-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sequencing Primers: Illumina Platform </td><td> Diverse leveranciers </td></tr><tr><td> UpTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CTT GCT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CTT GCT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Lees een UP-tag seq primer (100um) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lees een DOWN-tag seq primer (100um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lees 2 Index Sequencing primer (standaard Illumina R1 primer) (100um) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Extra Sequencing Reagentia / Equipment </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF PCR zuivering Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 29051 </td></tr><tr><td> Vacuümpomp </td><td> Elke leverancier </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vacuum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, een deel # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, part # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit assay buizen </td><td> Invitrogen, part # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% acrylamide plus 1% N, N&#39;-methyleen-bis-acrylamide, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, part # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Boorzuur </td><td> Sigma, part # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, part # E0306 </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfaat </td><td> Sigma, part # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, part # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidiumbromide oplossing </td><td> Bioshop, part # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0,5 M Ammoniumacetaat </td><td> Teknova, part # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM magnesiumacetaat tetrahydraat </td><td> Sigma, part # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1 mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Zie 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Natriumacetaat, pH 5,2 </td><td> Teknova, part # S0297 </td></tr><tr><td> Snelheid vacuum </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Single-Lees Cluster Generation Kit </td><td> Illumina, part # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Sequencing Kit v4 </td><td>Illumina, part # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBE recept <table border="1"><tbody><tr><td> Bedragen </td><td> Reagentia </td></tr><tr><td> 108 gram </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 gram </td><td> Boorzuur </td></tr><tr><td> 40ml </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg dH 2 O tot 1L markeren </td></tr></tbody></table> 12% polyacrylamide gel recept <table border="1"><tbody><tr><td> Volumes </td><td> Reagentia </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% acrylamide plus 1% N, N&#39;-methyleen-bis-acrylamide, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 ul </td><td> 10% ammoniumpersulfaat </td></tr><tr><td> Totaal volume: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag primer mix: Resuspendeer Uptag en Buptagkanmx4 elk in DDH 2 O bij 100 uM, meng in een verhouding van 1:1 voor een uiteindelijke concentratie van 50 uM elk. Bewaren bij -20 ° C. Downtag primer mix: Resuspendeer Dntag en Bdntagkanmx4 elk in DDH 2 O bij 100 uM, meng in een verhouding van 1:1 voor een uiteindelijke concentratie van 50 uM elk. Bewaren bij -20 ° C. Gemengde oligonucleotiden: Resuspendeer elk van de volgende acht oligo (standaard ontzout) in DDH 2 O bij 100 uM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Meng een gelijk volume van de acht oligonucleotiden voor een uiteindelijke concentratie van 12,5 uM elk. 12X MES voorraad: Voor 10 ml en los op 0,7 g MES vrije zuur monohydraat en 1,93 g MES natriumzout in 8 ml moleculaire biologie kwaliteit water. Na het mengen goed, controleer de pH en pas als dat nodig is om een ​​pH 6,5-6,7. Voeg water toe tot een totaal volume van 10 ml. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht (bv, wikkel de buis in folie). Vervangen als oplossing wordt zichtbaar geel of na 6 maanden. 2X hybridisatiebuffer: Voor 50 ml, meng 8,3 ml van 12X MES voorraad (vanaf 2.9.14), 17,7 ml 5 M NaCl, 4,0 ml van 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Tween 20 (vol / vol), en 19,9 ml gefilterd DDH 2 O. Filter steriliseren. Was A: Meng 300 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 699 ml DDH 2 O. Filter steriliseren. Was B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 849 ml DDH 2 O. Filter steriliseren. Barcode sequencing primers In UP-tag primer sequenties van de 5 &#39;staart (vet) zijn Illumina specifieke adapter sequenties opgenomen in de F-en R-primer. De variabele sequentie (cursief) staat voor de 5-mer indexering tag gebruikt in de multiplexen / index read-out. De drie &#39;staart (onderstreept) vertegenwoordigt de gemeenschappelijke primer aan weerszijden van de uptag barcode en is nodig om de gist barcodes te versterken. In DOWN-tag primer sequenties van de 5 &#39;staart is identiek aan 5&#39; staart van UP-tag primers (Illumina specifieke volgorde), maar de drie &#39;staart (onderstreept) wordt vervangen door de gemeenschappelijke primers die worden gebruikt om het versterken DOWN- tag barcodes.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

Op grond van ontwikkelingen in de next generation sequencing technologie, hebben we toegang tot nieuwe genoomsequenties bijna dagelijks. Het tempo van deze voorschotten aan het versnellen is, met de belofte een grotere diepte en breedte. In het licht van deze buitengewone ontwikkelingen, de behoefte aan snelle, parallel methoden om de functie van een gen te definiëren wordt steeds belangrijker. Collecties van genoom-brede deletiemutanten in gisten en E. coli hebben gediend als werkpaarden voor de functionele karakterisering van gen-functie, maar deze aanpak is niet schaalbaar, de huidige gen-deletie benaderingen vereisen elk van de duizenden genen die een genoom te worden verwijderd en gecontroleerd bestaan. Pas nadat dit werk voltooid is kunnen we nastreven high-throughput fenotypering. In de afgelopen tien jaar heeft ons laboratorium verfijnd een portfolio van concurrerende, geminiaturiseerde, high-throughput genoom-brede analyses die uitgevoerd kunnen worden in parallel. Dit parallellisatie is mogelijk door het opnemen van DNA &#39;tags&#39;, of &#39;barcodes,&#39; in elke mutant, met de barcode die als een proxy voor de mutatie en men kan de barcode overvloed maatregel mutant fitheid te beoordelen. In deze studie willen we de kloof tussen de DNA-sequentie en de streepjescode mutant collecties te vullen. Om dit te bereiken introduceren we een gecombineerde transposon verstoring-barcoding aanpak die zich opent parallel barcode assays voor nieuw gesequenced, maar slecht gekarakteriseerd microben. Ter illustratie van deze aanpak presenteren we een nieuw Candida albicans streepjescode verstoring van het verzamelen en beschrijven hoe zowel de microarray-gebaseerde en de volgende generatie sequencing-gebaseerde platforms kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van 10.000 - 1000000 gen-gen en drug-gen interacties in een enkel experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Yeast Colony Embedding Method

Gist Colony integratiemethode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomische MRI - een openbare hulpbron voor het bestuderen van Sequence patronen binnen Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformatie van de Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...