Name: competitive genomic screens of barcoded yeast libraries
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

אנו מודים רון דייויס, אדם Deutschbauer, ואת HIP HOP כולו במעבדה באוניברסיטת טורונטו לדיונים וייעוץ. CN הוא נתמך על ידי מענקים הלאומי לחקר הגנום האנושי (מספר גרנט HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, ו - סרטן האגודה הקנדית (# 020380). JO נתמך על ידי תוכנית סטנפורד הדרכה הגנום (מספר גרנט T32 HG00044 מן הלאומי לחקר הגנום האנושי) לבין המכון הלאומי לבריאות (מספר גרנט P01 GH000205). ג&quot;ג נתמך על ידי RO1 NHGRI HG003317 והחברה הקנדית למלחמה בסרטן, גרנט # 020380, TD ואת סידור דונלי המרכז נתמך בחלקו על ידי מענקי הקרן הקנדית חדשנות לד&quot;ר. ברנדה אנדרוז וג&#39;ק גרינבלט. AMS נתמך על ידי האוניברסיטה של ​​אחוות פתח טורונטו.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome.">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile.">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling:+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast.">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li><li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing.">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li><li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן, אנו התווה פרוטוקול, עם שינוי צנוע, יכול בקלות להיות מותאמים למגוון רחב של אוספים קיימים אוספים מוטציה המינימרקטים של מיקרואורגניזמים שונים על מנת ליצור קולקציות מוטציה מתויג. אנו מדגישים כי בעוד אנו מדווחים על פרוטוקול mutagenesis transposon מתוייגים עבור שמרים פתוגניים ג אלביקנס, פרוטוקול דומה מאוד יכול להתאים למגוון רחב של פטריות unicellular. השתנה, פרוטוקול זה עובד היטב בחיידקים 13, וכיום אוספים במשך מספר הגנום פטריות וחיידקים נוספים בבנייה. נכון לעכשיו, assay זה מספק מקיף בלבד, הגנום כולו מסך משוחדת עבור גנים קטנים אינטראקציות מולקולה. תכונה אחת משכנעת במיוחד של assay הוא לא ידע קודם של הגן או מולקולה קטנה נדרשת. למרות ההיקף והעוצמה של מבחני אלה, עבירות שלהם במעבדות אחרות כבר הפריע במקצת על ידי השקעות ההון הראשוני אינפורמטיקה וכלים לניתוח התוצאות. עם אימוץ של readout רצף הדור הבא בשילוב עם כלים חזקים לניתוח, אנו מצפים להגדיל את האימוץ שלהם.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אנטיביוטיקה </td><td> הספק וקטלוג מספרים </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> סיגמא, חלק # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> סיגמא, חלק # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomycin </td><td> סיגמא, חלק # S0692 </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> סיגמא, חלק # C0378 </td></tr><tr><td> ה-DNA לנקות וערכות ריכוז </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep ספין Miniprep Kit </td><td> Qiagen, חלק # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​מקסי פלסמיד Kit </td><td> Qiagen, חלק # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR ערכת טיהור </td><td> Qiagen, חלק # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick ג&#39;ל הפקת Kit </td><td> Qiagen, חלק # 28704 </td></tr><tr><td> PCR ו ריאגנטים אלקטרופורזה </td><td></td></tr><tr><td> תקי פולימראז ה-DNA (Mg-free) הצפת </td><td> ניו אינגלנד Biolabs, חלק # M0320L </td></tr><tr><td> הפתרון Deoxynucleotide Mix </td><td> ניו אינגלנד Biolabs, חלק # N0447L </td></tr><tr><td> 25 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td> סיגמא, חלק # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, טוען לצבוע, וגם חומצות גרעין כתם מתאים ג&#39;ל אלקטרופורזה </td><td> שונים </td></tr><tr><td> חיץ 10X טה </td><td> סיגמא, חלק # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb פלוס סולם DNA </td><td> Invitrogen, חלק # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD מרק </td><td></td></tr><tr><td> 10 גרם של תמצית שמרים </td><td> סיגמא, חלק # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 גרם Bacto peptone </td><td> BD Biosciences, חלק # 211677 </td></tr><tr><td> 20 גרם דקסטרוז </td><td> סיגמא, חלק # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> רב pipettes (1000, 200, ו - 20 μL) </td><td> שונים </td></tr><tr><td> מאגרי pipetting פנויה </td><td> שונים </td></tr><tr><td> 15 ו 50 צנטריפוגות צינורות מ&quot;ל </td><td> שונים </td></tr><tr><td> 96 - ו 384, באר עמוקה צלחות טוב </td><td> Axygen מדעי, חלק # P-2ml-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-384-היטב היטב PCR צלחות הסרט חותם </td><td> שונים </td></tr><tr><td> פלייט רולר עבור רב גם צלחות איטום </td><td> סיגמא, חלק # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C ו 37 ° C רועד חממות לגידול חיידקים ושמרים על הצלחות ועל צינורות </td><td> שונים </td></tr><tr><td> במבחנה transposon mutagenesis </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 Transposase </td><td> Epicentre ביוטכנולוגיות, חלק # TNP92110 </td></tr><tr><td> תפוקה גבוהה טרנספורמציה </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT ערכת הכנה פלסמיד </td><td> אדג&#39; Biosystems, חלק # 84359 </td></tr><tr><td> פוליאתילן גליקול, משקל מולקולרי 3350 </td><td> שונים </td></tr><tr><td> ליתיום אצטט </td><td> סיגמא, חלק # 517992 </td></tr><tr><td> 6 צלחות, טוב, סטרילי </td><td> קורנינג, חלק # 3335 </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​uridine </td><td> סיגמא, חלק # U3750 </td></tr><tr><td> 100x טריס-EDTA חיץ פתרון </td><td> סיגמא, חלק # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> שונים </td></tr><tr><td> סלמון testis-DNA </td><td> סיגמא, חלק # 1626 </td></tr><tr><td> צמיחה של אוספים המינימרקטים </td><td></td></tr><tr><td> 48 גם הצלחות, אם גדל תרבויות צלחות </td><td> גריינר, חלק # M9437 </td></tr><tr><td> צלחת חותמות דבק </td><td> ABgene, חלק # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 מ&quot;ל צלוחיות תרבות </td><td> שונים </td></tr><tr><td> יכולת ספיגת ספקטרופוטומטר </td><td> שונים </td></tr><tr><td> טמפרטורה מבוקרת שייקר עבור 250 מ&quot;ל צלוחיות או ספקטרופוטומטר רועד </td><td> שונים </td></tr><tr><td> Safe-Lock Tube Microcentrifuge, 2 מ&quot;ל </td><td> Eppendorf, חלק # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> הכלאה ציוד </td><td></td></tr><tr><td> הכלאה תנור 640 </td><td> Affymetrix, חלק # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip Fluidic תחנה 450 </td><td> Affymetrix, חלק # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray סורק 3000 </td><td> Affymetrix, חלק # 00-0212 </td></tr><tr><td> מי האמבט רתיחה עם מתלה צף </td><td> שונים </td></tr><tr><td> הכלאה מתכלים </td><td></td></tr><tr><td> Genflex תג 16K מערך v2 </td><td> Affymetrix, חלק # 511331 </td></tr><tr><td> Denhardt של פתרון, להתרכז 50X </td><td> סיגמא, חלק # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin, R-phycoerythrin המצומד (SAPE) </td><td> Invitrogen, חלק # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock Tube Microcentrifuge, 0.5 מ&quot;ל </td><td> Eppendorf, חלק # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> קטנטן קשוח כתמים </td><td> מגוונים ביוטק, חלק # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> BioRad, חלק # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> סיגמא, חלק # T2700 </td></tr><tr><td> MES monohydrate חומצה חינם </td><td> סיגמא, חלק # M5287 </td></tr><tr><td> MES מלח נתרן </td><td> סיגמא, חלק # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> סיגמא, חלק # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> סיגמא, חלק # S2015 </td></tr><tr><td> ביולוגיה מולקולרית כיתה מים </td><td> סיגמא, חלק # W4502 </td></tr><tr><td> הכלאה primers </td><td> ספקים שונים (desalting רגילה) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &quot;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&quot; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &quot;ביוטין GTCGACCTGCAGCGTACG-3&quot; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &quot;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&quot; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &quot;ביוטין GAAAACGAGCTCGAATTCATCG-3&quot; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &quot;ביוטין CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3&quot; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &quot;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&quot; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &quot; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &quot; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &quot; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &quot; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &quot; </td></tr><tr><td> סידור primers: פלטפורמה Illumina </td><td> ספקים שונים </td></tr><tr><td> UpTag קדימה (100uM) </td><td> 5 &quot;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T גת GTC CAC GAG GTC TCT 3&quot; </td></tr><tr><td> UpTag הפוך (100uM) </td><td> 5 &quot;AAT גת ACG מהפקולטה לרוקחות אוכלים ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T אננננן GTC GAC CTG החטיבה CGT ACG 3&quot; </td></tr><tr><td> DownTag קדימה (100uM) </td><td> 5 &quot;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&quot; </td></tr><tr><td> DownTag הפוך (100uM) </td><td> 5 &quot;AAT גת ACG מהפקולטה לרוקחות אוכלים ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T אננננן CGG CGG TGT TCT CGT AG 3` </td></tr><tr><td> קראו 1 UP-תג seq פריימר (100uM) </td><td> 5 &quot;GTC GAC CTG החטיבה CGT ACG 3&quot; </td></tr><tr><td> קראו 1 למטה תג פריימר seq (100uM) </td><td> 5 &quot;CGG CGG TGT TCT CGT AG 3&quot; </td></tr><tr><td> קראו 2 סידור אינדקס פריימר (פריימר תקן Illumina R1) (100uM) </td><td> 5 &quot;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC-T 3&quot; </td></tr><tr><td> סידור ריאגנטים נוספים / ציוד </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF-PCR ערכת טיהור </td><td> Qiagen, חלק # 29051 </td></tr><tr><td> לשאוב אבק </td><td> כל ספק </td></tr><tr><td> Macherey-נגל אבק סעפת </td><td> Macherey-נגל, חלק # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen קוואנט-IT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, חלק # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen קיוביט צינורות assay </td><td> Invitrogen, חלק # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% acrylamide N פלוס 1%, N&#39;-מתילן-bis-acrylamide, 37.5:1 </td><td> ביו רד, חלק # 161-0148 </td></tr><tr><td> מאגר טריס </td><td> סיגמא, חלק # T1503-1 ק&quot;ג </td></tr><tr><td> בור Acid </td><td> סיגמא, חלק # B6768-500 גרם </td></tr><tr><td> EDTA 0.5m, pH 8.0 </td><td> Teknova, חלק # E0306 </td></tr><tr><td> אמוניום Persulfate </td><td> סיגמא, חלק # A3678-25 גרם </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, חלק # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidium פתרון ברומיד </td><td> Bioshop, חלק # ETB444.10 </td></tr><tr><td> אמוניום אצטט 0.5m </td><td> Teknova, חלק # A2000 </td></tr><tr><td> מגנזיום 10mm אצטט tetrahydrate </td><td> סיגמא, חלק # M0631-100 גרם </td></tr><tr><td> 1mm EDTA, pH 8.0 </td><td> ראה EDTA 0.5m, pH 8.0 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> שונים </td></tr><tr><td> נתרן אצטט, pH 5.2 </td><td> Teknova, חלק # S0297 </td></tr><tr><td> מהירות בריק </td><td> שונים </td></tr><tr><td> יחיד קרא הדור Cluster Kit </td><td> Illumina, חלק # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36 ג סידור v4 Kit </td><td>Illumina, חלק # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> TBE 10X המתכון <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סכומים </td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> 108 גרם </td><td> מאגר טריס </td></tr><tr><td> 55 גרם </td><td> בור Acid </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> 0.5m EDTA (pH 8.0) </td></tr><tr><td colspan="2"> הוסף DH 2 O ל 1L סימן </td></tr></tbody></table> 12% ג&#39;ל polyacrylamide מתכון <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כרכים </td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> 5.8 מ&quot;ל </td><td> 40% acrylamide N פלוס 1%, N&#39;-מתילן-bis-acrylamide, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 מ&quot;ל </td><td> DH 2 O </td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 μl </td><td> 10% אמוניום Persulfate </td></tr><tr><td> נפח כולל: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag תערובת פריימר: Resuspend Uptag ו Buptagkanmx4 כל DDH 2 O ב 100 מיקרומטר, ואז לערבב ביחס של 1:1 עבור ריכוז סופי של 50 מיקרומטר אחד. חנות ב -20 ° C. Downtag תערובת פריימר: Resuspend Dntag ו Bdntagkanmx4 כל DDH 2 O ב 100 מיקרומטר, ואז לערבב ביחס של 1:1 עבור ריכוז סופי של 50 מיקרומטר אחד. חנות ב -20 ° C. מעורב oligonucleotides: Resuspend כל אחת משמונה oligos הבאים (תקן desalted) ב DDH 2 O ב 100 מיקרומטר: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. מערבבים נפח שווה של שמונה oligonucleotides ריכוז סופי של 12.5 מיקרומטר אחד. 12X מניות MES: במשך 10 מ&quot;ל, 0.7 גרם להמיס monohydrate MES חומצה חופשית 1.93 גרם מלח MES נתרן 8 מ&quot;ל מים הביולוגיה המולקולרית כיתה. לאחר ערבוב טוב, pH לבדוק ולהתאים במידת הצורך עד pH 6.5-6.7. מוסיפים מים כדי בהיקף כולל של 10 מ&quot;ל. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C מוגן מפני האור (למשל, לעטוף את צינור בנייר כסף). החלף אם הפתרון הופך צהוב בעליל או אחרי 6 חודשים. הכלאה 2X חיץ: במשך 50 מ&quot;ל, מערבבים 8.3 מ&quot;ל של 12X MES מניות (מ 2.9.14), 17.7 מ&quot;ל של 5 M NaCl, 4.0 מ&quot;ל EDTA M 0.5, 0.1 מ&quot;ל של 10% Tween 20 (כרך / כרך), ו - 19.9 מ&quot;ל מסוננים DDH 2 O. סנן לעקר. שטפי: מערבבים 300 מ&quot;ל 20X SSPE, 1 מ&quot;ל Tween 10% (כרך / כרך א), 699 מ&quot;ל DDH 2 O. סנן לעקר. לשטוף B: מערבבים 150 מ&quot;ל 20X SSPE, 1 מ&quot;ל Tween 10% (כרך / כרך), 849 מ&quot;ל DDH 2 O. סנן לעקר. רצף ברקוד primers ב UP-תג רצפים פריימר הזנב &#39;5 (מודגש) הם Illumina רצפים מתאם מסוים שולבו פריימר F ו-R. רצף משתנה (הדגשה שלי) מייצג את תג 5-mer לאינדקס בשימוש ריבוב / מדד לקריאה החוצה. הזנב &#39;3 (קו תחתון) מייצג את פריימר משותף לאגף את הברקוד uptag והוא נדרש להגביר את ברקודים שמרים. בשנת תג מטה פריימר רצפים 5 &quot;זנב זהה 5&quot; זנב של UP-תג primers (רצף ספציפי Illumina), לעומת זאת, הזנב &#39;3 (קו תחתון) מוחלף עם פריימרים משותפים המשמשים להגביר את למטה תג ברקודים.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

בזכות ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא ריצוף, יש לנו גישה רצפי גנום חדש כמעט מדי יום. קצב ההתקדמות אלה מואצת, מבטיח יותר עומק ורוחב. לאור ההתפתחויות הללו יוצא דופן, את הצורך, שיטות מהיר במקביל להגדיר פונקציה הגן הופך להיות יותר ויותר חשוב. אוספים של הגנום כולו מוטציות מחיקה של שמרים וא coli שימשו סוסי עבודה לאפיון פונקציונלי של תפקוד הגנים, אך גישה זו אינה מדרגית הנוכחית גנים המחיקה גישות דורשים כל אחד אלפי גנים אשר מהווים הגנום למחיקה ומאומת. רק לאחר השלמת עבודה זו נוכל לפתח תפוקה גבוהה phenotyping. במהלך העשור האחרון, במעבדה שלנו מעודן פורטפוליו של הגנום כולו תחרותי, מיניאטורי תפוקה גבוהה, מבחני שניתן לבצע במקביל. הקבלה זה אפשרי בשל הכללת &quot;תגים&quot; ה-DNA, או &quot;ברקודים,&quot; לתוך כל מוטציה, עם הברקוד משמש פרוקסי עבור המוטציה, ואפשר למדוד את שפע ברקוד כדי להעריך את כושר מוטנטי. במחקר זה, אנו מבקשים למלא את הפער בין רצף הדנ&quot;א ואוספים מוטציה המינימרקטים. לשם כך אנחנו מציגים transposon בשילוב שיבוש-barcoding גישה שנפתחת מבחני ברקוד במקביל רצף החדש, אך מאופיינת גרוע חיידקים. כדי להמחיש זאת אנו מציגים גישה חדשה קנדידה אלביקנס אוסף שיבוש המבורקדים לתאר איך הן microarray המבוסס על רצף הבא מבוססי פלטפורמות הדור ניתן להשתמש כדי לאסוף 10,000 - 1,000,000 גנים גנים סמים גן אינטראקציות בניסוי יחיד.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Yeast Colony Embedding Method

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

הגנום MRI - משאב ציבורי עבור לימוד דפוסי בתוך רצף הדנ&quot;א הגנומי

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...