Name: competitive genomic screens of barcoded yeast libraries
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00
Duration: 11 min 59 s
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Ringraziamo Ron Davis, Adam Deutschbauer, e l&#39;intero laboratorio HIP HOP presso l&#39;Università di Toronto per le discussioni e consigli. NC è sostenuto da finanziamenti della National Human Genome Research Institute (Grant Numero HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, e Canadian Cancer Society (# 020380). JO è stato sostenuto dal Programma di Stanford Formazione Genoma (Grant Numero T32 HG00044 dal National Human Genome Research Institute) e il National Institutes of Health (Grant Numero P01 GH000205). GG è supportato dal RO1 NHGRI HG003317 e la Canadian Cancer Society, Grant # 020380, TD e il Donnelly Sequencing Center è sostenuto in parte da finanziamenti della Fondazione canadese per l&#39;innovazione di Drs. Brenda e Jack Andrews Greenblatt. AMS è supportato da una borsa di studio dell&#39;Università di Toronto Open.

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	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui, abbiamo delineato un protocollo che, con modeste modifiche, può essere facilmente adattato ad una vasta gamma di collezioni esistenti di codici a barre collezioni mutante di microrganismi diversi per creare tag collezioni mutante. Sottolineiamo che, mentre noi abbiamo riportato un protocollo di mutagenesi trasposone tag per i patogeni lievito C. albicans, un protocollo molto simile potrebbe essere adattato ad una grande varietà di funghi unicellulari. Modificato, questo protocollo funziona bene nei batteri 13, e attualmente collezioni per una serie di ulteriori genomi fungini e batterici sono in costruzione. Al momento, questo test fornisce l&#39;unica completa, genome-wide a schermo imparziali per gene-piccole interazioni molecola. Una caratteristica particolarmente interessante del saggio è che nessuna conoscenza preliminare del gene o piccola molecola è richiesto. Nonostante la portata e la potenza di questi test, la loro trasferibilità in altri laboratori è stato ostacolato in qualche modo con l&#39;investimento di capitale iniziale e gli strumenti informatici per l&#39;analisi dei risultati. Con l&#39;adozione di una lettura prossima sequenza di generazione combinata con strumenti affidabili per l&#39;analisi, ci aspettiamo che la loro adozione ad aumentare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotici </td><td> Vendor e catalogo numeri </td></tr><tr><td> Carbenicillina </td><td> Sigma, parte # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Sigma, parte # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomicina </td><td> Sigma, parte # S0692 </td></tr><tr><td> Cloramfenicolo </td><td> Sigma, parte # C0378 </td></tr><tr><td> DNA di pulizia e kit di concentrazione </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, parte # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Kit Maxi plasmidi </td><td> Qiagen, parte # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, parte # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, parte # 28704 </td></tr><tr><td> PCR e reagenti elettroforesi </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi (Mg-free) Buffer </td><td> New England Biolabs, parte # M0320L </td></tr><tr><td> Soluzione Mix desossinucleotide </td><td> New England Biolabs, parte # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, parte # 63036 </td></tr><tr><td> Agarosio, carico colorante e acido nucleico macchia adatto per elettroforesi su gel </td><td> Vari </td></tr><tr><td> 10X tampone TAE </td><td> Sigma, parte # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Inoltre DNA Ladder </td><td> Invitrogen, parte # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD brodo </td><td></td></tr><tr><td> 10 g di estratto di lievito </td><td> Sigma, parte # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto peptone </td><td> BD Biosciences, parte # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g di destrosio </td><td> Sigma, parte # D9434 </td></tr><tr><td> Da laboratorio </td><td></td></tr><tr><td> Pipette multicanale (1000, 200, e 20 mL) </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Monouso serbatoi pipettaggio </td><td> Vari </td></tr><tr><td> 15 e 50 provette ml </td><td> Vari </td></tr><tr><td> 96 - e pozzetti 384-pozzo profondo </td><td> Axygen Scientifico, parte # P-2ML-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-bene e 384 pozzetti PCR e film di tenuta </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Rullo di lamiera per la sigillatura a più pozzetti </td><td> Sigma, parte # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C e 37 ° C agitando incubatori per la crescita di batteri e lieviti su piastre e tubi </td><td> Vari </td></tr><tr><td> In vitro trasposone mutagenesi </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 trasposasi </td><td> Biotecnologie Epicentre, parte # TNP92110 </td></tr><tr><td> High-throughput trasformazione </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Prep Kit plasmidi </td><td> Bordo Biosystems, parte # 84359 </td></tr><tr><td> polietilene glicole, peso molecolare 3350 </td><td> Vari </td></tr><tr><td> acetato di litio </td><td> Sigma, parte # 517992 </td></tr><tr><td> 6-pozzetti, sterile </td><td> Corning, parte # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml uridina </td><td> Sigma, parte # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA soluzione tampone </td><td> Sigma, parte # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Vari </td></tr><tr><td> salmone testicolo DNA </td><td> Sigma, parte # 1626 </td></tr><tr><td> La crescita delle collezioni barcode </td><td></td></tr><tr><td> 48-pozzetti, qualora la crescita culture in lastre </td><td> Greiner, parte # M9437 </td></tr><tr><td> Sigillante adesivo </td><td> ABgene, parte # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 mL cultura fiaschi </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Spettrofotometro in grado di assorbanza </td><td> Vari </td></tr><tr><td> A temperatura controllata shaker per 250 ml o palloni spettrofotometro agitazione </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Safe-Lock provetta, 2 ml </td><td> Eppendorf, parte # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Ibridazione attrezzature </td><td></td></tr><tr><td> Ibridazione Forno 640 </td><td> Affymetrix, parte # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip fluidico Stazione 450 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0212 </td></tr><tr><td> Bagno di acqua bollente con cremagliera galleggiante </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Ibridazione di consumo </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag 16K Array v2 </td><td> Affymetrix, parte # 511331 </td></tr><tr><td> Soluzione Denhardt, il concentrato di 50X </td><td> Sigma, parte # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidina, R-ficoeritrina coniugato (SAPE) </td><td> Invitrogen, parte # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock provetta, 0,5 ml </td><td> Eppendorf, parte # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversificato Biotech, parte # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, parte # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, parte # T2700 </td></tr><tr><td> MES monoidrato acido libero </td><td> Sigma, parte # M5287 </td></tr><tr><td> MES sale di sodio </td><td> Sigma, parte # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, parte # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, parte # S2015 </td></tr><tr><td> Biologia molecolare acqua grado </td><td> Sigma, parte # W4502 </td></tr><tr><td> Ibridazione Primer </td><td> Vari fornitori (dissalazione di serie) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotina-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sequencing Primer: Piattaforma Illumina </td><td> Vari fornitori </td></tr><tr><td> UpTag Avanti (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Avanti (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Leggi 1 UP-tag seguenti primer (100um) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leggi 1 GIU-tag Primer seq (100um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leggi 2 Primer Sequencing Index (standard Illumina fondo R1) (100um) </td><td> 5 &#39;AC ATTO CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Reagenti Sequencing Ulteriori / attrezzature </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF Kit di purificazione PCR </td><td> Qiagen, parte # 29051 </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> Qualsiasi fornitore </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vacuum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, parte # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, parte # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit saggio tubi </td><td> Invitrogen, parte # Q32856 </td></tr><tr><td> Acrilamide 40% più 1% di N, N&#39;-metilene-bis-acrilamide, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, parte # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Acido borico </td><td> Sigma, parte # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, parte # E0306 </td></tr><tr><td> Ammonio persolfato </td><td> Sigma, parte # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, parte # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Bromuro di etidio Soluzione </td><td> Bioshop, parte # ETB444.10 </td></tr><tr><td> Ammonio acetato 0.5M </td><td> Teknova, parte # A2000 </td></tr><tr><td> 10mM acetato di magnesio tetraidrato </td><td> Sigma, parte # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Vedi 0.5M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Di sodio acetato, pH 5,2 </td><td> Teknova, parte # S0297 </td></tr><tr><td> Velocità a vuoto </td><td> Vari </td></tr><tr><td> Leggi singolo cluster Kit Generation </td><td> Illumina, parte # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36 quater Sequencing Kit v4 </td><td>Illumina, parte # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> TBE ricetta 10X <table border="1"><tbody><tr><td> Importi </td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> 108 grammi </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 grammi </td><td> Acido borico </td></tr><tr><td> 40ml </td><td> 0.5M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungi dH 2 O a 1L marchio </td></tr></tbody></table> 12% di poliacrilammide ricetta gel <table border="1"><tbody><tr><td> Volumi </td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> Acrilamide 40% più 1% di N, N&#39;-metilene-bis-acrilamide, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> TBE 10X </td></tr><tr><td> 140 microlitri </td><td> Persolfato di ammonio 10% </td></tr><tr><td> Volume totale: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag mix di fondo: Risospendere Uptag e Buptagkanmx4 ciascuno in DDH 2 O a 100 micron, quindi mescolare in un rapporto di 1:1 per una concentrazione finale di 50 micron ciascuna. Conservare a -20 ° C. Downtag mix di fondo: Risospendere Dntag e Bdntagkanmx4 ciascuno in DDH 2 O a 100 micron, quindi mescolare in un rapporto di 1:1 per una concentrazione finale di 50 micron ciascuna. Conservare a -20 ° C. Oligonucleotidi mista: Risospendere ciascuna delle seguenti otto oligos (standard dissalate) in DDH 2 O a 100 mM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Mescolare un volume equivalente di otto oligonucleotidi per una concentrazione finale di 12,5 mM ciascuno. 12X MES magazzino: Per 10 ml, sciogliere 0,7 g monoidrato acido libero MES e 1,93 g di sale di sodio MES in 8 acqua biologia molecolare grado ml. Dopo aver mescolato bene, controllare il pH e regolare, se necessario, a pH 6,5-6,7. Aggiungere acqua per un volume totale di 10 ml. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce (ad esempio, avvolgere il tubo in alluminio). Sostituire se visibilmente soluzione diventa gialla o dopo 6 mesi. Ibridazione tampone 2X: Per 50 ml, miscelare 8,3 ml di 12X MES magazzino (dal 2.9.14), 17,7 ml di 5 M NaCl, 4,0 ml di 0.5 M EDTA, 0,1 ml di 10% di Tween 20 (vol / vol), e 19,9 ml di filtrato DDH 2 O. Filtro sterilizzare. Lavare A: Mescolare 300 ml 20X SSPE, 1 ml di Tween 10% (vol / vol), 699 ml di DDH 2 O. Filtro sterilizzare. Lavare B: Mescolare 150 ml 20X SSPE, 1 ml di Tween 10% (vol / vol), 849 ml di DDH 2 O. Filtro sterilizzare. Codice a barre sequenza primer In UP-tag sequenze primer 5 &#39;coda (in grassetto) sono Illumina sequenze specifico adattatore incorporato nel fondo F e R. La sequenza variabile (corsivo) rappresenta il 5-mer tag di indicizzazione utilizzato in multiplexing / index read-out. Coda di 3 &#39;(sottolineato) rappresenta l&#39;innesco comune che fiancheggiano il codice a barre uptag ed è necessario per amplificare i codici a barre lievito. In GIU-tag Primer sequenze 5 &#39;coda è identico a 5&#39; coda di UP-tag primer (Illumina sequenza specifica), tuttavia, il 3 &#39;coda (sottolineato), è sostituito con il primer comuni che vengono utilizzati per amplificare il DOWN- tag codici a barre.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

In virtù dei progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, abbiamo accesso alle sequenze del genoma nuovo quasi ogni giorno. Il tempo di questi progressi sta accelerando, promettendo una maggiore profondità e ampiezza. Alla luce di questi progressi straordinari, la necessità di una rapida, metodi paralleli per definire la funzione del gene diventa sempre più importante. Collezioni di genome-wide mutanti di delezione in lieviti ed E. coli sono serviti come cavalli da tiro per la caratterizzazione funzionale della funzione del gene, ma questo approccio non è scalabile, attuale gene-cancellazione approcci richiedono ciascuno delle migliaia di geni che costituiscono il genoma da eliminare e verificato. Solo dopo questo lavoro è completo possiamo perseguire high-throughput fenotipizzazione. Negli ultimi dieci anni, il nostro laboratorio ha perfezionato un portafoglio di competitivo, miniaturizzati, ad alta produttività genome-wide test che possono essere eseguite in parallelo. Questo parallelizzazione è possibile perché l&#39;inclusione dei &#39;tag&#39; del DNA, o &#39;codici a barre,&#39; in ogni mutante, con il codice a barre che funge da proxy per la mutazione e si può misurare l&#39;abbondanza di codici a barre per valutare idoneità mutante. In questo studio, cerchiamo di colmare il divario tra sequenza del DNA e codice a barre collezioni di mutanti. Per fare questo introduciamo un combinato trasposone interruzione-codici a barre approccio che apre saggi di codici a barre parallele di nuova sequenza, ma poco caratterizzato microbi. Per illustrare questo approccio vi presentiamo una nuova collezione di Candida albicans interruzione codice a barre e di descrivere come sia microarray-based e sequenziamento di nuova generazione basati su piattaforme possono essere utilizzate per raccogliere 10.000 - 1.000.000 gene-gene e le interazioni farmaco-gene in un singolo esperimento.

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Abbiamo sviluppato completa, imparziale genoma schermate per capire gene-farmaco e interazioni gene-ambiente. Metodi per lo screening queste collezioni mutanti sono presentati.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomica risonanza magnetica - una risorsa pubblica per lo Studio Patterns sequenza all&#39;interno del DNA genomico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Trasformazione genomica del Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...