Name: competitive genomic screens of barcoded yeast libraries
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Vi tackar Ron Davis, Adam Deutschbauer och hela HÖFTFLYGTUR laboratorium vid universitetet i Toronto för diskussioner och rådgivning. KN stöds med bidrag från National Human Genome Research Institute (licensnummer HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84.305, och kanadensiska Cancerfonden (# 020.380). JO stöddes av Stanford Genome Training Program (licensnummer T32 HG00044 från National Human Genome Research Institute) och National Institutes of Health (licensnummer P01 GH000205). GG stöds av NHGRI RO1 HG003317 och den kanadensiska Cancerfonden, Grant # 020.380, TD och Donnelly Sekvensering Centre stöds delvis av anslag från det kanadensiska institutet för innovation till Dr. Brenda Andrews och Jack Greenblatt. AMS stöds av ett University of Toronto öppen gemenskap.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome.">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile.">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling:+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast.">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li><li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing.">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li><li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Här beskrivs vi ett protokoll som, med blygsamma ändringar, kan enkelt anpassas till ett brett spektrum av befintliga samlingar av streckkodade mutant samlingar av olika mikroorganismer för att skapa taggade muterade samlingar. Vi betonar att även om vi har rapporterat ett protokoll om taggade transposon mutagenes för patogena jäst C. albicans, en mycket liknande protokoll kunde anpassas till en mängd olika encelliga svampar. Ändrad fungerar detta protokoll och i bakterier 13, och för närvarande samlingar för ytterligare ett antal svamp-och bakteriella genomen är under uppbyggnad. För närvarande ger denna analys är den enda heltäckande, genomet hela objektiva skärm för gen-småmolekylära interaktioner. En särskilt spännande inslag i analysen är att ingen tidigare kunskap av genen eller små molekyler krävs. Trots omfattningen och kraften i dessa analyser har deras överföras till andra laboratorier har hindrat något av den ursprungliga kapitalinvesteringar och IT-verktyg för analys av resultaten. Med antagandet av en ny generation sekvens utläsning kombinerat med kraftfulla verktyg för analys, förväntar vi oss att de har antagits öka.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotika </td><td> Säljaren och katalognummer </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Sigma, del # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Sigma, del # K1876 </td></tr><tr><td> spektinomycin </td><td> Sigma, del # S0692 </td></tr><tr><td> Kloramfenikol </td><td> Sigma, del # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Städa och kit koncentration </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, del # 27.106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen, del # 12.663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, del # 28.106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, del # 28.704 </td></tr><tr><td> PCR och reagens för elektrofores </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA-polymeras (Mg-fri) buffert </td><td> New England Biolabs, del # M0320L </td></tr><tr><td> Deoxynukleotid Lösning Mix </td><td> New England Biolabs, del # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, del # 63.036 </td></tr><tr><td> Agaros, laddningsfärg och nukleinsyra fläcken lämplig för gelelektrofores </td><td> Olika </td></tr><tr><td> 10X TAE buffert </td><td> Sigma, del # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Plus DNA stege </td><td> Invitrogen, del # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD buljong </td><td></td></tr><tr><td> 10 g jäst extrakt </td><td> Sigma, del # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto pepton </td><td> BD Biosciences, del # 211.677 </td></tr><tr><td> 20 g dextros </td><td> Sigma, del # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> Multikanalpipetter (1000, 200 och 20 mikroliter) </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Disponibel pipettering reservoarer </td><td> Olika </td></tr><tr><td> 15 och 50 ml centrifugrör </td><td> Olika </td></tr><tr><td> 96 - och 384-brunnars Deep Well Plates </td><td> Axygen Vetenskapliga, del # P-2 ml-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-brunnars och 384-brunnars PCR-plattor och tätning film </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Plate rulle för tätning med flera bra plattor </td><td> Sigma, del # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C och 37 ° C skaka inkubatorer för växande bakterier och jäst på tallrikar och i rör </td><td> Olika </td></tr><tr><td> In vitro transposon mutagenes </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 Transposase </td><td> Epicentrum Bioteknik, del # TNP92110 </td></tr><tr><td> Hög genomströmning omvandling </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit </td><td> Edge Biosystems, del # 84.359 </td></tr><tr><td> polyetylenglykol, molekylvikt 3350 </td><td> Olika </td></tr><tr><td> litium acetat </td><td> Sigma, del # 517.992 </td></tr><tr><td> 6-brunnars plattor, steril </td><td> Corning, del # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml uridin </td><td> Sigma, del # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA-buffertlösning </td><td> Sigma, del # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Olika </td></tr><tr><td> lax testiklar DNA </td><td> Sigma, del # 1626 </td></tr><tr><td> Tillväxt av streckkodade samlingar </td><td></td></tr><tr><td> 48-brunnars plattor, om växande kulturer i form av plattor </td><td> Greiner, del # M9437 </td></tr><tr><td> Självhäftande platta tätningar </td><td> ABgene, del # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 ml kultur kolvar </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Spektrofotometer som kan absorbans </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Temperaturreglerade shaker för 250 ml kolvar eller skakningar spektrofotometer </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Safe-Lock mikrocentrifugrör, 2 mL </td><td> Eppendorf, del # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hybridisering utrustning </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisering Ugn 640 </td><td> Affymetrix, del # 800.138 </td></tr><tr><td> GeneChip fluidic Station 450 </td><td> Affymetrix, del # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, del # 00-0212 </td></tr><tr><td> Kokande vattenbad med rörlig rack </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Hybridisering förbrukningsvaror </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag 16K Array v2 </td><td> Affymetrix, del # 511.331 </td></tr><tr><td> Denhardt lösning, 50X koncentrat </td><td> Sigma, del # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin, R-fykoerytrin konjugat (SAPE) </td><td> Invitrogen, del # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock mikrocentrifugrör, 0,5 ml </td><td> Eppendorf, del # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, del # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, del # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, del # T2700 </td></tr><tr><td> MES fri syra monohydrat </td><td> Sigma, del # M5287 </td></tr><tr><td> MES natriumsalt </td><td> Sigma, del # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, del # 71.386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, del # S2015 </td></tr><tr><td> Molekylärbiologi årskurs vatten </td><td> Sigma, del # W4502 </td></tr><tr><td> Hybridisering Primers </td><td> Olika leverantörer (standard avsaltning) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3 &quot; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &quot;biotin-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&quot; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3 &quot; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &quot;biotin-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&quot; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &quot;biotin-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&quot; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3 &quot; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &quot; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &quot; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &quot; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &quot; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &quot; </td></tr><tr><td> Sekvensering primers: Illumina Plattform </td><td> Olika leverantörer </td></tr><tr><td> UpTag framåt (100uM) </td><td> 5 &quot;Luftfartsverket GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC-T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&quot; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100uM) </td><td> 5 &quot;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC-T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&quot; </td></tr><tr><td> DownTag framåt (100uM) </td><td> 5 &quot;Luftfartsverket GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC-T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&quot; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100uM) </td><td> 5 &quot;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC-T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3` </td></tr><tr><td> Läs 1 UP-tagg artiklar primer (100uM) </td><td> 5 &quot;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&quot; </td></tr><tr><td> Läs 1 NED-tagg artiklar primer (100uM) </td><td> 5 &quot;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&quot; </td></tr><tr><td> Läs 2 primer Index Sekvensering (standard Illumina R1 primer) (100uM) </td><td> 5 &quot;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC-T-3&quot; </td></tr><tr><td> Ytterligare Sekvensering Reagenser / Utrustning </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF-PCR-rening Kit </td><td> Qiagen, del # 29.051 </td></tr><tr><td> Vakuumpump </td><td> Någon leverantör </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vacuum grenrör </td><td> Macherey-Nagel, del # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-IT dsDNA BR-analys Kit </td><td> Invitrogen, del # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen qubit analys rör </td><td> Invitrogen, del # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% akrylamid plus 1% N, N&#39;-metylen-bis-akrylamid, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, del # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, del # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Borsyra </td><td> Sigma, del # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, del # E0306 </td></tr><tr><td> Ammonium Persulfate </td><td> Sigma, del # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShop, del # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidiumbromidlösning </td><td> BioShop, del # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0,5 M Ammoniumacetat </td><td> Teknova, del # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM Magnesiumacetattetrahydratlösning </td><td> Sigma, del # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mm EDTA, pH 8,0 </td><td> Se 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Natriumacetat, pH 5,2 </td><td> Teknova, del # S0297 </td></tr><tr><td> Hastighet vakuum </td><td> Olika </td></tr><tr><td> Single-Läs Cluster Generation Kit </td><td> Illumina, del # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Sekvensering Kit v4 </td><td>Illumina, del # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBE recept <table border="1"><tbody><tr><td> Belopp </td><td> Reagenser </td></tr><tr><td> 108 gram </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 gram </td><td> Borsyra </td></tr><tr><td> 40ml </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Lägg dH 2 O 1L markera </td></tr></tbody></table> 12% Polyakrylamidgelen recept <table border="1"><tbody><tr><td> Volymerna </td><td> Reagenser </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% akrylamid plus 1% N, N&#39;-metylen-bis-akrylamid, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 l </td><td> 10% Ammonium Persulfate </td></tr><tr><td> Total volym: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag primermix: Resuspendera Uptag och Buptagkanmx4 vardera i DDH 2 O vid 100 mikroM, blanda sedan i en 1:1 ratio för en slutlig koncentration av 50 mikroM varje. Förvara vid -20 ° C. Downtag primermix: Resuspendera Dntag och Bdntagkanmx4 vardera i DDH 2 O vid 100 mikroM, blanda sedan i en 1:1 ratio för en slutlig koncentration av 50 mikroM varje. Förvara vid -20 ° C. Blandade oligonukleotider: Resuspendera vart och ett av följande åtta oligos (standard desalted) i DDH 2 O vid 100 mikroM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Blanda en lika stor volym av de åtta oligonukleotider för en slutlig koncentration av 12,5 mikroM vardera. 12X MES lager: För 10 ml, lös upp 0,7 g MES fri syra monohydrat och 1,93 g MES natriumsalt i 8 ml molekylärbiologisk kvalitet vatten. Efter blandning väl, kontrollera pH och justera vid behov till pH 6,5-6,7. Tillsätt vatten till en total volym på 10 ml. Filtrera sterilisera och förvara vid 4 ° C, skyddat från ljus (t.ex. linda röret i folie). Byt om lösningen blir synligt gult eller efter 6 månader. 2X Hybridisering buffert: För 50 ml, blanda 8,3 ml 12X MES lager (från 2.9.14), 17,7 ml 5 M NaCl, 4,0 ml 0,5 M EDTA, 0,1 ml av 10% Tween 20 (vol / vol) och 19,9 ml filtrerat DDH 2 O. Filter sterilisera. Tvätta A: Blanda 300 ml 20X specialföretag, 1 ml 10% Tween (vol / vol), 699 ml DDH 2 O. Filter sterilisera. Tvätta B: Blanda 150 ml 20X specialföretag, 1 ml 10% Tween (vol / vol), 849 ml DDH 2 O. Filter sterilisera. Barcode sekvensering grundfärger I UP-taggen primer sekvenser på 5 &quot;svans (fet stil) är Illumina särskild adapter sekvenser införlivas i F och R-primer. Den rörliga sekvens (kursiv stil) representerar 5-Mer indexering taggen används i multiplexering / index avläsning. Den 3 &quot;tail (understruket) representerar den gemensamma primern flankerar uptag streckkoden och behövs för att förstärka jästen streckkoder. I Down-taggen primer sekvenser på 5 &quot;svansen är identisk med 5&quot; svans av UP-tagg primers (Illumina viss ordning), men är 3 &quot;svans (understrukna) ersättas med den gemensamma primers som används för att förstärka NED- tagg streckkoder.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

Genom framsteg i nästa generations sekvensering teknik har vi tillgång till nya genomet sekvenser nästan dagligen. Tempot i dessa framsteg accelererar, lovande större djup och bredd. Mot bakgrund av dessa extraordinära framsteg, blir behovet av snabba, parallella metoder för att definiera genfunktion allt viktigare. Samlingar av genomet hela radering mutanter i jäst och E. coli har fungerat som arbetshästar för funktionell karakterisering av geners funktion, men detta tillvägagångssätt är inte skalbar, aktuell gen-radering tillvägagångssättet förutsätter att vart och ett av tusentals gener som utgör en arvsmassa som ska tas bort och verifieras. Först efter detta arbete är klart kan vi följa med hög genomströmning fenotypning. Under det senaste decenniet har vårt laboratorium förfinat en portfölj av konkurrenskraftiga miniatyriserade, med hög genomströmning genomet hela analyser som kan utföras parallellt. Denna parallellisering är möjligt på grund av införandet av DNA &quot;taggar&quot; eller &quot;streckkoder,&quot; i varje mutant, med streckkod fungerar som en proxy för mutationen och en kan mäta streckkoden överflöd att bedöma muterade fitness. I denna studie vill vi fylla gapet mellan DNA-sekvens och streckkodade mutant samlingar. För att åstadkomma detta presenterar vi en kombinerad transposon störning-streckkodning synsätt som öppnar upp parallella streckkod analyser till nyligen ordnat, men dåligt kännetecknas mikrober. För att illustrera denna metod presenterar vi en ny Candida albicans streckkodade störningar insamling och beskriva hur både microarray-baserade och nästa generations sekvensering-baserade plattformar kan användas för att samla in 10.000 - 1.000.000 gen-genen och drog-gen interaktioner i ett enda experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Vi har utvecklat omfattande, objektiva genomet hela skärmar för att förstå gen-läkemedel och gen-miljö interaktioner. Metoder för screening av dessa muterade samlingar presenteras.

Konkurrenskraftiga Genomic skärmar av streckkodade Jäst bibliotek

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Storskaliga skärmar Metagenomic bibliotek

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolering av genomisk DNA från mus Tails

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Tekniska Demonstration av hela genomet Array jämförande genomik hybridisering

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Stora Sätt Miljö Genomic Bibliotek Produktion

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Rening av mitokondrier från jästceller

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Utveckling av automatiserad bildbehandling och analys för zebrafisk kemiska skärmar.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Yeast Colony Embedding Method

Jäst Colony Bädda Metod

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomic MR - en allmän resurs för att studera Sequence Patterns inom Genomiskt DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomiskt Transformation av Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...