Name: competitive genomic screens of barcoded yeast libraries
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Biz Ron Davis, Adam Deutschbauer, ve tüm HIP HOP laboratuar Toronto Üniversitesi&#39;nde tartışmalar ve öneriler için teşekkür ederim. CN, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü (Grant Numarası HG000205), RO1 HG003317 CIHR MOP-84.305, ve Kanada Kanser Derneği (020.380) hibe ile desteklenmektedir. JO Stanford Genom Eğitim Programı (Hibe Numarası T32 HG00044 Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (Hibe Numarası P01 GH000205) tarafından desteklenmiştir. GG, Kanadalı Dr Yenilik Vakfı hibe tarafından kısmen desteklenen NHGRI RO1 HG003317 ve Kanada Kanser Derneği, Grant # 020.380, TD ve Donnelly Sıralama Merkezi tarafından desteklenmektedir. Brenda Andrews ve Jack Greenblatt. AMS, Toronto açın Bursu bir Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome.">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile.">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling:+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast.">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li><li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing.">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li><li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, biz Etiketli mutant koleksiyonları oluşturmak için farklı mikroorganizmaların barkodlu mutant koleksiyonları mevcut koleksiyonları geniş bir yelpazede kolayca adapte edilebilir, mütevazı bir değişiklik ile bir protokol sıraladı. Patojenik maya C etiketli transposon mutagenez bir protokol bildirdin Biz vurgulamak albicans, çok benzer bir protokol, tek hücreli mantarlar geniş bir yelpazede adapte olabilir . Modifiye Bu protokol, bakteri 13 iyi çalışıyor ve şu anda ek fungal ve bakteriyel genomların bir dizi koleksiyonları yapım aşamasındadır . Şu anda, bu testte, gen-küçük molekül etkileşimleri için tek kapsamlı, genom tarafsız ekran sağlar. Testinin özellikle ikna edici bir özelliği gen ya da küçük molekül hiçbir ön bilgi gerekli olmasıdır. Bu testlerin kapsam ve gücüne rağmen, diğer laboratuarlara aktarılabilirliği sonuçların analizi için başlangıç ​​sermayesi yatırım ve bilişim araçları ile biraz engellemiştir. Analizi için güçlü araçlar ile birlikte bir sonraki nesil dizisi okuma kabulü ile, onların evlat edinme artmasını bekliyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiyotikler </td><td> Satıcı ve katalog numaraları </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Sigma, part # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td> Sigma, part # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomycin </td><td> Sigma, part # S0692 </td></tr><tr><td> Kloramfenikol </td><td> Sigma, part # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Temizlik-up ve konsantrasyon kitleri </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kiti </td><td> Qiagen, part # 27.106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plazmid Maxi Seti </td><td> Qiagen, part # 12.663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Arıtma Kiti </td><td> Qiagen, parçası # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Jel Ekstraksiyon Seti </td><td> Qiagen, part # 28.704 </td></tr><tr><td> PCR ve elektroforez reaktifler </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA Polimeraz (Mg-serbest) Tampon </td><td> New England Biolabs, part # M0320L </td></tr><tr><td> Deoksinükleotid Çözüm Mix </td><td> New England Biolabs, part # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, part # 63.036 </td></tr><tr><td> Agaroz yükleme, boya, ve nükleik asit jel elektroforezi için uygun leke </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 10X TAE tampon </td><td> Sigma, part # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Plus DNA Ladder </td><td> Invitrogen, parçası # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD suyu </td><td></td></tr><tr><td> 10 g maya özü </td><td> Sigma, part # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto pepton </td><td> BD Biosciences, part # 211.677 </td></tr><tr><td> 20 g dekstroz </td><td> Sigma, part # D9434 </td></tr><tr><td> Laboratuvar </td><td></td></tr><tr><td> Çok kanallı pipetler (1000, 200, ve 20 mcL) </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık pipetleme rezervuarları </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 15 ve 50 ml santrifüj tüplerine </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 96 - ve 384-Eh Derin Şey Tabaklar </td><td> Axygen Bilimsel parçası # P-2ml-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-ve 384-iyi PCR plakaları ve mühür filmi </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Plaka silindir, conta çok iyi plakaları için </td><td> Sigma, part # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C ve 37 ° C plakalar üzerinde bakteri ve maya büyüyen ve tüpler sallayarak inkübatörler </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> In vitro transpozon mutagenez </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 Transposase </td><td> Epicentre Biyoteknoloji, part # TNP92110 </td></tr><tr><td> Yüksek verim dönüşüm </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Plazmid Hazırlık Seti </td><td> Kenar Biosystems, part # 84.359 </td></tr><tr><td> polietilen glikol, moleküler ağırlığı 3350 </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Lityum asetat </td><td> Sigma, part # 517.992 </td></tr><tr><td> Steril, tabak 6-iyi </td><td> Corning, part # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml üridin </td><td> Sigma, part # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA tampon çözelti </td><td> Sigma, part # T9285 </td></tr><tr><td> 1x TE/0.1M LiOAc </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> somon testis DNA </td><td> Sigma, part # 1626 </td></tr><tr><td> Barkodlu koleksiyonları Büyüme </td><td></td></tr><tr><td> 48 kuyucuğu; plakalar kültürlerin büyüyen eğer </td><td> Greiner, part # M9437 </td></tr><tr><td> Yapışkan levha contaları </td><td> ABgene, kısmen # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 mL kültür matara </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Absorbans yetenekli Spektrofotometre </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 250 ml&#39;lik şişeler veya sallayarak spektrofotometre ısı kontrollü çalkalayıcı </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Güvenli-Lock Mikrosantrifüj Tüp, 2 mL </td><td> Eppendorf, kısmen # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hibridizasyon ekipman </td><td></td></tr><tr><td> Hibridizasyon Fırını 640 </td><td> Affymetrix, part # 800.138 </td></tr><tr><td> GeneChip akışkan İstasyonu 450 </td><td> Affymetrix, parça # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Tarayıcı 3000 </td><td> Affymetrix, parça # 00-0212 </td></tr><tr><td> Kayan kabinle birlikte Kaynar su banyosu </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Hibridizasyon sarf </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Etiket 16K Dizi v2 </td><td> Affymetrix, part # 511.331 </td></tr><tr><td> Denhardt Çözüm 50X konsantre </td><td> Sigma, part # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin, Ar-fikoeritrin konjuge (SAPE) </td><td> Invitrogen, part # S866 </td></tr><tr><td> Güvenli-Lock Mikrosantrifüj Tüp, 0,5 mL </td><td> Eppendorf, kısmen # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Ufacık Tough-Spotlar </td><td> Çeşitlendirilmiş Biotech, part # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> BioRad, part # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, part # T2700 </td></tr><tr><td> MES serbest asit monohidrat </td><td> Sigma, part # M5287 </td></tr><tr><td> MES sodyum tuzu </td><td> Sigma, part # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, part # 71.386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, part # S2015 </td></tr><tr><td> Moleküler biyoloji notu suyu </td><td> Sigma, part # W4502 </td></tr><tr><td> Hibridizasyon Astarlar </td><td> Çeşitli tedarikçileri (standart tuzsuzlaştırma) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotin GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotin GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotin CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;3 GTCGACCTGCAGCGTACG&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 3 5&#39;CTACGAGACCGACACCG &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sıralama Astarlar: Illumina Platformu </td><td> Çeşitli tedarikçilerden </td></tr><tr><td> UpTag İleri (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Ters (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T nnnnn GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag İleri (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Ters (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T nnnnn CGG TGT CGG TCT CGT AG, 3 ` </td></tr><tr><td> 1 okuyun UP-tag sıra astar (100uM) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> 1 AŞAĞI-etiket sıra astar (100uM) </td><td> 3 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG&#39; </td></tr><tr><td> 2 Endeksi Sıralama astar (standart Illumina R1 astar) (100uM) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Ek Sıralama Reaktifler / Ekipman </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF PCR arıtma Takımı </td><td> Qiagen, part # 29.051 </td></tr><tr><td> Vakum pompası </td><td> Herhangi bir satıcı </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vakum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, kısmen # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, part # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit tahlil tüpleri </td><td> Invitrogen, part # Q32856 </td></tr><tr><td> % 40 akrilamid artı% 1 N, N&#39;-metilen-bis-akrilamid, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, part # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Borik Asit </td><td> Sigma, part # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8.0 </td><td> Teknova, part # E0306 </td></tr><tr><td> Amonyum persulfate </td><td> Sigma, part # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, part # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidium Bromür Çözümü </td><td> Bioshop, part # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0,5 M amonyum asetat </td><td> Teknova, part # A2000 </td></tr><tr><td> 10mM Magnezyum asetat tetrahidrat </td><td> Sigma, part # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mm EDTA, pH 8.0 </td><td> 0,5 M EDTA, pH 8.0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Sodyum asetat, pH 5.2 </td><td> Teknova, part # S0297 </td></tr><tr><td> Hız vakum </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Tek-Read Küme Üretimi Kiti </td><td> Illumina, kısmen # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> V4 36C Sıralama Seti </td><td>Illumina, part # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10x TBE tarifi <table border="1"><tbody><tr><td> Tutarlar </td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> 108 gram </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 gram </td><td> Borik Asit </td></tr><tr><td> 40ml </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8.0) </td></tr><tr><td colspan="2"> DH 2 O 1L işareti </td></tr></tbody></table> % 12 Poliakrilamid jel tarifi <table border="1"><tbody><tr><td> Hacimleri </td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> 5.8 ml </td><td> % 40 akrilamid artı% 1 N, N&#39;-metilen-bis-akrilamid, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 ul </td><td> % 10 amonyum persülfat </td></tr><tr><td> Toplam hacmi: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag astar karışımı: Süspanse edin Uptag ve GKD 2 O Buptagkanmx4 her 100 mcM, daha sonra her biri 50 mcM nihai bir konsantrasyon 1:1 oranında karıştırın . -20 ° C&#39;de muhafaza Downtag astar karışımı: Süspanse edin Dntag ve Bdntagkanmx4 her biri 100 mcM GKD 2 O, sonra 50 mcM her son bir konsantrasyon için 1:1 oranında karıştırın . -20 ° C&#39;de muhafaza Karışık oligonükleotidler: 100 mcM GKD 2 O her aşağıdaki sekiz oligos (standart desalted) süspanse edin: Uptag,,, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. 12.5 mcM her son bir konsantrasyon için sekiz oligonükleotidler bir eşit miktarda karıştırın. 12X MES stok: 10 ml için 0.7 g MES serbest asit monohidrat ve 1.93 g MES sodyum tuzu, 8 ml moleküler biyoloji notu su çözülür. Iyi karıştırıldıktan sonra, pH ve pH 6,5-6,7 gerekirse ayarlayabilirsiniz. Toplam hacim 10 ml su ekleyin. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C ışığı (örneğin, folyo tüp sarın) karşı korumalıdır. Çözüm, gözle görülür bir şekilde sarı veya 6 ay sonra hale gelmesi durumunda değiştirin. 2X Hibridizasyon tamponu: 50 ml, 8.3 ml (2.9.14) 12X (MES) hisse senetleri, 5 M NaCl, 4.0, 0.5 M EDTA, 0.1 ml% 10 Tween 20 (hacim / hacim) ml, ve 19.9 ml GKD süzülmüş 17.7 ml karıştırmak 2 O. Sterilize Filtresi. A Yıkama: Mix 300 ml 20X SSPE, 1 ml% 10 Tween (hacim / hacim), 699 ml GKD 2 O. Sterilize Filtresi. Yıkama B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 ml% 10 Tween (hacim / hacim), 849 ml GKD 2 O. Sterilize Filtresi. Barkod sıralama primerler UP-etiket astar dizileri 5 &#39;kuyruk (kalın), F ve R astar dahil Illumina belirli bir bağdaştırıcı dizileri . Değişken dizisi (italik), dizin / çoğullama okuma kullanılan 5-mer indeksleme etiketi temsil eder . 3 &#39;kuyruk (altı çizili) uptag barkod kuşatan ortak astar temsil eder ve maya barkod yükseltmek için gereklidir. AŞAĞI-tag astar 5 Ancak, 3 &#39;kuyruk (altı çizili) yükseltmek için kullanılan ortak primerler ile değiştirilir, UP-tag primerler (Illumina dizisi) kuyruk kuyruk 5 özdeş&#39; dizileri AŞAĞI etiketi barkod.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

Yeni nesil sıralama teknolojilerindeki gelişmeler sayesinde, neredeyse her gün yeni gen dizilimlerini erişimi var. Bu gelişmelerin temposu hızlanıyor, daha fazla derinlik ve genişlik umut verici. Bu olağanüstü gelişmelerin ışığında, genin işlevini tanımlamak için hızlı, paralel yöntemleri için ihtiyaç her zamankinden daha önemli hale gelir. Maya ve E. genom silme mutantlar koleksiyonları coli gen fonksiyon fonksiyonel karakterizasyonu için beygirleri olarak hizmet etmiş, ancak bu yaklaşım ölçeklenebilir değildir, mevcut gen silme yaklaşımları silinir ve doğrulanabilir bir genomu oluşturan genlerin her biri binlerce gerektirir. Bu çalışma tamamlandıktan sonra, biz yüksek verim fenotipleme takip edebilirsiniz. Geçtiğimiz on yıl boyunca, laboratuar, rekabetçi, minyatür, yüksek verimli genomu paralel olarak yapılabilir testleri geniş bir portföy rafine vardır. Bu paralelizasyon barkod mutasyonu için bir vekil olarak hizmet, çünkü DNA &#39;etiketler&#39;, ya da her bir mutant haline &#39;barkod&#39; dahil edilmesi mümkündür ve bir mutant spor değerlendirmek için barkod bolluk ölçebilirsiniz. Bu çalışmada, DNA dizisi ve barkodlu mutant koleksiyonları arasındaki boşluğu doldurmak için çalışırlar. Bunu başarmak için yeni dizisi paralel barkod deneyleri kadar açılır, ancak zayıf mikropların karakterize bir kombine transposon kesintisiz barkodlama yaklaşımı tanıtmak. Bu yaklaşım göstermek için yeni bir Candida albicans barkodlu bozulması koleksiyonunu sergilemek ve hem mikroarray tabanlı ve yeni nesil sıralama tabanlı platformlar 10,000 toplamak için nasıl kullanılabileceğini tarif - 1.000.000, gen-gen ve ilaç-gen etkileşimleri tek bir deney .

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Yeast Colony Embedding Method

Maya Colony Gömme Yöntemi

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

MR Genomik - Sıra Desenler Genomik DNA içinde incelenmesi için Kamu Kaynak

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Picoeukaryote genomik Dönüşüm<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...