Name: extraction of high molecular weight dna from microbial mats
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00
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Ce travail a été financé par la National Science Foundation Programme génomique environnementale (Subvention n ° 0723707 EF-).

1. Extraction de cellule microbienne: <ol><li> Homogénéiser les tapis microbiens avec un pilon stériles meulage en mélangeant soigneusement. Placer environ tous les 30 g (poids humide) de matériau mat homogénéisé dans un contenant stérile d&#39;un mélangeur Waring, ajouter environ 100 ml de NaCl 1 M (ou une concentration spécifique à l&#39;échantillon en utilisation), et mélanger à trois reprises à vitesse moyenne pendant 1 min avec refroidissement intermittent dans un congélateur à -20 ° C pendant ...

<ol>
	<li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms+in+intertidal+systems:+an+overview.">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li><li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats.">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li><li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments.">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li><li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials.">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li><li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples.">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li><li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis.">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li><li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats.">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li><li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+does+matter:+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics.">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology &#38; Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li><li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+the+Soil+Metagenomic:+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms.">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li><li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Rhodopsin:+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea.">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li></ol>

Étant donné que l&#39;élimination totale des cellules du complexe et très diversifié échantillons des tapis microbiens n&#39;est pas pratique, la principale préoccupation est de savoir comment bien les cellules extraites de représenter la communauté microbienne globale tapis. Dans une étude précédente, la PCR-DGGE analyse des gènes microbiens ARNr 16S ont montré que les cinq étapes d&#39;élimination des cellules utilisées dans le présent protocole d&#39;extraits des cellules qui sont représentatifs de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Le polyéthylène glycol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% dans 1,2 M de NaCl </td></tr><tr><td> L&#39;acétate de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT Assay Kit ADNdb </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> BDH Chemicals </td><td> BDH8014 </td><td> Conc appropriées. </td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> hexamétaphosphate de sodium </td><td> EMD Chemicals </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA système </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spectrophotomètre </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Crosslinker ultraviolet </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mélangeur Waring </td><td> Waring de laboratoire </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of high molecular weight dna from microbial mats

Analyse réussie et exacte et l&#39;interprétation des données métagénomiques dépend de l&#39;extraction efficace de haute qualité, l&#39;ADN de haut poids moléculaire de la communauté (HMW). Cependant, les échantillons environnementaux posent souvent des tapis de difficultés à obtenir de grandes concentrations de haute qualité, l&#39;ADN HMW. Tapis microbiens hypersalin contiennent des quantités élevées de substances polymériques extracellulaires (EPS) 1 et les sels qui peuvent inhiber les applications en aval de l&#39;ADN extrait. Les méthodes directes et dures sont souvent utilisés dans l&#39;extraction d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons réfractaires. Ces méthodes sont généralement utilisées parce que le BPA dans des nattes, une matrice adhésive, lie l&#39;ADN 2,3 lors de la lyse directe. En raison de méthodes d&#39;extraction plus sévères, l&#39;ADN se fragmente en petites tailles 4,5,6. L&#39;ADN devient donc inapproprié pour le vecteur de clonage à grande insérer. Afin de contourner ces limitations, nous présentons une méthodologie améliorée pour en extraire l&#39;ADN HMW de bonne qualité et la quantité de tapis microbiens hypersalin. Nous avons utilisé une méthode indirecte impliquant la séparation des cellules microbiennes de la matrice mat fond par mélange et centrifugation différentielle. Une combinaison de procédés mécaniques et chimiques a été utilisé pour extraire et purifier l&#39;ADN des cellules microbiennes extrait. Notre protocole de rendements d&#39;environ 2 pg d&#39;ADN HMW (35-50 ko) par gramme d&#39;échantillon mat, avec un A 260/280 ratio de 1,6. Par ailleurs, l&#39;amplification des gènes d&#39;ARNr 16S 7 suggère que le protocole est en mesure de minimiser ou éliminer les effets inhibiteurs de contaminants. Nos résultats fournissent une méthodologie appropriée pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir HMW tapis microbiens fonctionnels pour les études métagénomiques et peut être applicable à d&#39;autres échantillons environnementaux à partir de laquelle l&#39;extraction d&#39;ADN est un défi.

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Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Nous fournissons un protocole amélioré pour l&#39;extraction ADN de haut poids moléculaire à partir de tapis microbiens hypersalin. Les cellules microbiennes sont séparés de la matrice mat avant l&#39;extraction de l&#39;ADN et de purification. Cela améliore la concentration, la qualité et la taille de l&#39;ADN. Le protocole peut être utilisé pour d&#39;autres échantillons réfractaires.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie des communautés microbiennes - Interview

Recherche

Biologie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

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Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

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Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

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