Name: extraction of high molecular weight dna from microbial mats
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00
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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Environmental Genomics Program (Grant No EF-0723707) gefördert.

1. Microbial Cell Extraction: <ol><li> Homogenisieren mikrobiellen Matten mit einer sterilen Schleifen Pistill durch Mischen gründlich. Legen Sie etwa alle 30 g (Feuchtgewicht) homogenisiert Matte Material in sterilen Behälter von Waring, etwa 100 ml 1 M NaCl (oder eine Konzentration spezifischen Probe in use) hinzufügen, und fügen sich dreimal bei mittlerer Geschwindigkeit für 1 min mit intermittierende Kühlung in einem -20 ° C Gefrierschrank für 1 min. Übertragen Sie die Gülle in einen 250 mL Zentrifuge Fl...

<ol>
	<li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms+in+intertidal+systems:+an+overview.">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li><li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats.">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li><li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments.">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li><li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials.">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li><li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples.">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li><li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis.">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li><li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats.">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li><li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+does+matter:+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics.">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology &#38; Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li><li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+the+Soil+Metagenomic:+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms.">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li><li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Rhodopsin:+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea.">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li></ol>

Da die gesamte Zelle Entnahme aus komplexen und sehr unterschiedlichen mikrobiellen Matte Proben nicht praktikabel ist, ist die wichtigste Angelegenheit, wie gut die extrahierten Zellen die gesamte mikrobielle Matte Gemeinschaft darstellen. In einer früheren Studie zeigte PCR-DGGE Analyse mikrobieller 16S rRNA-Gene, dass die fünf Zelle Ausbauschritte in diesem Protokoll verwendeten Zellen, die repräsentativ für die Gesamtheit mikrobiellen Matte Gemeinschaft 7 sind Extrakte. Die tatsächliche Anzahl der Ze...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenglycol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% in 1,2 M NaCl </td></tr><tr><td> Kaliumacetat </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT dsDNA Assay Kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> BDH Chemicals </td><td> BDH8014 </td><td> Entsprechende konz. </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% in Wasser </td></tr><tr><td> Natriumhexametaphosphat </td><td> EMD Chemicals </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% in Wasser </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA-System </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spektralphotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraviolet Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waring </td><td> Waring Labor </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of high molecular weight dna from microbial mats

Erfolgreiche und genaue Analyse und Interpretation von Daten metagenomische ist abhängig von der effizienten Gewinnung von hochwertigen, mit hohem Molekulargewicht (HMW)-Community DNA. Doch Umwelt-mat Proben stellen häufig Schwierigkeiten zu erhalten hohe Konzentrationen von hoher Qualität, HMW-DNA. Hypersalinen mikrobiellen Matten enthalten hohe Mengen an extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 1 und Salze, die Downstream-Anwendungen der extrahierten DNA hemmen können. Direkte und harte Methoden sind oft in der DNA-Extraktion aus feuerfestem Proben verwendet. Diese Methoden sind in der Regel verwendet, da das EPS in Matten, Klebstoff-Matrix, bindet DNA 2,3 während der direkten Lyse. Als Folge der härteren Extraktionsmethoden, DNA wird in kleinen Größen 4,5,6 fragmentiert. Die DNA wird somit ungeeignet für große Insert-Vektor Klonen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, melden wir eine verbesserte Methodik zur HMW-DNA von guter Qualität und Quantität von hypersaline mikrobiellen Matten extrahieren. Wir verwendeten eine indirekte Methode, die die Trennung von mikrobiellen Zellen aus dem Hintergrund Matte Matrix durch Mischen und differentielle Zentrifugation. Eine Kombination aus mechanischen und chemischen Verfahren wurde verwendet, um zu extrahieren und zu reinigen DNA aus den extrahierten mikrobieller Zellen. Unser Protokoll ergibt etwa 2 ug HMW-DNA (35-50 kb) pro Gramm Matte Probe, mit einer A 260/280 Ratio von 1,6. Darüber hinaus schlägt Amplifikation von 16S rRNA-Gene 7, die das Protokoll in der Lage, minimieren oder zu eliminieren hemmenden Wirkungen von Verunreinigungen ist. Unsere Ergebnisse liefern eine geeignete Methode zur Extraktion von HMW-DNA aus mikrobiellen Matten für funktionale metagenomische Studien und kann auf andere Umwelt-Proben, aus denen die DNA-Extraktion ist eine Herausforderung.

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Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Wir bieten ein verbessertes Protokoll zur Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht aus hypersaline mikrobielle Matten. Mikrobielle Zellen sind von der Matte Matrix vor der DNA-Extraktion und Reinigung getrennt. Dies erhöht die Konzentration, Qualität und Größe der DNA. Das Protokoll kann für andere feuerfeste Proben verwendet werden.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie mikrobieller Gemeinschaften - Interview

Forschung

Biologie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Modifizierte Methoden zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz reduzieren das Kontaminationspotenzial

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...