Name: extraction of high molecular weight dna from microbial mats
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00
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Questo lavoro è stato finanziato dal Programma National Science Foundation Environmental Genomica (Grant No. EF-0723707).

1. Cella di estrazione microbica: <ol><li> Omogeneizzare stuoie microbica con un pestello sterile macinazione mescolando accuratamente. Mettere circa 30 g tutti (peso a umido) di materiale opaco omogeneizzato in un contenitore sterile di Waring frullatore, aggiungere circa 100 ml di 1 M NaCl (o una specifica concentrazione di campione in uso), e si fondono tre volte a velocità media per 1 minuto con raffreddamento intermittente in un congelatore di -20 ° C per 1 min. Trasferire l&#39;impasto in una bottiglia da 250 ...

<ol>
	<li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms+in+intertidal+systems:+an+overview.">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li><li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats.">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li><li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments.">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li><li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials.">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li><li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples.">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li><li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis.">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li><li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats.">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li><li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+does+matter:+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics.">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology &#38; Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li><li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+the+Soil+Metagenomic:+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms.">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li><li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Rhodopsin:+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea.">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li></ol>

Dato che la rimozione totale di cellule da campioni microbiche complesse e molto diverse tappetino non è pratico, la preoccupazione principale è come le cellule estratte rappresentano la complessiva comunità microbica tappeto. In uno studio precedente, PCR-DGGE analisi dei geni rRNA 16S microbica ha mostrato che le cinque fasi di rimozione delle cellule utilizzate in questo protocollo estratti di cellule che sono rappresentativi della comunità microbica complessiva tappeto 7. Il numero effettivo di estraz...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilene glicole 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% in 1,2 M di NaCl </td></tr><tr><td> Acetato di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT Assay kit dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Prodotti chimici BDH </td><td> BDH8014 </td><td> Conc appropriato. </td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% in acqua </td></tr><tr><td> sodio esametafosfato </td><td> EMD chimici </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% in acqua </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA sistema </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spettrofotometro </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex </td><td> Scientific Industries Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Crosslinker ultravioletti </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waring Blender </td><td> Waring laboratorio </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of high molecular weight dna from microbial mats

Analisi di successo e preciso e l&#39;interpretazione dei dati metagenomica dipende l&#39;estrazione efficiente di alta qualità, ad elevato peso molecolare (HMW) del DNA della comunità. Tuttavia, i campioni di mat ambientali costituiscono spesso difficoltà ad ottenere grandi concentrazioni di alta qualità, il DNA HMW. Stuoie microbica hypersaline contengono elevate quantità di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 1 e sali che possono inibire le applicazioni a valle di DNA estratto. Metodi diretti e duri sono spesso utilizzati per l&#39;estrazione del DNA da campioni di refrattari. Questi metodi sono generalmente utilizzati perché l&#39;EPS in stuoie, una matrice adesiva, lega il DNA 2,3 durante la lisi diretta. Come risultato di metodi di estrazione più severe, il DNA viene frammentato in piccole dimensioni 4,5,6. Il DNA diventa così inadeguato per la grande inserto clonazione vettore. Per aggirare queste limitazioni, si riporta un metodo migliore per estrarre il DNA HMW di buona qualità e la quantità di stuoie microbica hypersaline. Abbiamo impiegato un metodo indiretto che coinvolge la separazione di cellule microbiche dalla matrice sfondo opaco attraverso la miscelazione e la centrifugazione differenziale. Una combinazione di procedure meccaniche e chimiche è stato utilizzato per estrarre e purificare il DNA da cellule microbiche estratti. Il nostro protocollo produce circa 2 mg di HMW DNA (35-50 kb) per grammo di campione tappeto, con un 260/280 Un rapporto di 1,6. Inoltre, l&#39;amplificazione dei geni rRNA 16S 7 si evince che il protocollo è in grado di minimizzare o eliminare gli effetti inibitori dei contaminanti. I nostri risultati forniscono una metodologia adeguata per l&#39;estrazione del DNA da HMW stuoie microbica per gli studi funzionali metagenomica e può essere applicabile ad altri campioni ambientali dai quali l&#39;estrazione del DNA è una sfida.

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Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Forniamo un protocollo migliore per l&#39;estrazione del DNA alto peso molecolare da stuoie microbica hypersaline. Cellule microbiche sono separate dalla matrice tappetino prima dell&#39;estrazione del DNA e la purificazione. Questo aumenta la concentrazione, la qualità e le dimensioni del DNA. Il protocollo può essere utilizzato per altri campioni refrattari.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

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JoVE Journal

Biology

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologia delle comunità microbiche - Intervista

Ricerca

Biologia

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

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Mucina Agarosio elettroforesi su gel: Western Blotting per glicoproteine ​​ad alto peso molecolare


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