Name: extraction of high molecular weight dna from microbial mats
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av National Science Foundation Environmental Genomics programmet (bidrag nr EF-0.723.707).

1. Microbial Cell Extraktion: <ol><li> Homogenisera mikrobiella mattor med en steril slipning stöt genom att blanda noggrant. Placera ungefär alla 30 g (våtvikt) av homogeniserade matta material i sterila behållare av Waring mixer, tillsätt ungefär 100 ml 1 M NaCl (eller en koncentration som är specifika för prov i bruk), och blandar tre gånger på medelhög hastighet under 1 minut med intermittent kylning i en -20 ° C frys i 1 min. Överför suspensionen i en 250 ml centrifug flaska och fylla de återståen...

<ol>
	<li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms+in+intertidal+systems:+an+overview.">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li><li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats.">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li><li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments.">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li><li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials.">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li><li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples.">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li><li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis.">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li><li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats.">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li><li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+does+matter:+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics.">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology &#38; Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li><li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+the+Soil+Metagenomic:+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms.">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li><li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Rhodopsin:+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea.">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li></ol>

Med tanke på att de totala celler avlägsnas från komplexa och mycket olikartade prover mikrobiell matta inte är praktiskt, är det främsta problemet hur väl de extraherade cellerna representerar gemenskapens övergripande mikrobiell matta. I en tidigare studie visade PCR-DGGE analys av mikrobiella 16S rRNA gener som de fem cellen tas bort stegen används i detta protokoll extrakt celler som är representativa för den totala mikrobiella mattan samhället 7. Det faktiska antalet celler utvinning steg som...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn på reagens </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polyetylenglykol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% av 1,2 M NaCl </td></tr><tr><td> Kaliumacetat </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-IT dsDNA analys-kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNas </td><td> Epicentrum </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> BDH Kemikalier </td><td> BDH8014 </td><td> Lämpliga konc. </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% i vatten </td></tr><tr><td> natriumhexametafosfat </td><td> EMD Kemikalier </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% i vatten </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA-systemet </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spektrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraviolett Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waring mixer </td><td> Waring laboratorium </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of high molecular weight dna from microbial mats

Framgångsrika och korrekt analys och tolkning av metagenomic data är beroende av effektiv utvinning av hög kvalitet, med hög molekylvikt (HMW) Webbforum DNA. Men miljö-matta prov innebär ofta svårigheter att få stora koncentrationer av hög kvalitet, HMW DNA. Hypersaline mikrobiella mattor innehåller höga halter av extracellulärt polymeriska substanser (EPS) en och salter som kan hämma nedströms tillämpningar av extraherat DNA. Direkt och hårda metoder används ofta i DNA-extraktion från eldfast prover. Dessa metoder används vanligtvis på grund av EPS i Mats, en självhäftande matris, binder DNA 2,3 under direkt lys. Som en följd av hårdare extraktionsmetoder, DNA blir uppdelad i små storlekar 4,5,6. De DNA blir därmed olämpligt för stora sätter vektor kloning. För att kringgå dessa begränsningar, redovisar vi en förbättrad metod för att extrahera HMW DNA av god kvalitet och kvantitet från hypersaline mikrobiella mattor. Vi har anställt en indirekt metod där separation av mikrobiella celler från bakgrunden mattan matrisen genom blandning och differentierad centrifugering. En kombination av mekaniska och kemiska procedurer användes för att extrahera och rena DNA från den extraherade mikrobiella celler. Vår protokoll ger cirka 2 mikrogram HMW DNA (35-50 kb) per gram matta prov, med en A 260/280 förhållandet 1,6. Vidare föreslår förstärkning av 16S rRNA gener 7 att protokollet kan minimera eller eliminera eventuell hämmande effekter av föroreningar. Våra resultat ger en lämplig metod för utvinning av HMW DNA från mikrobiella mattor för funktionell metagenomic studier och kan tillämpas på andra miljöprover från vilken DNA-extraktion är en utmaning.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats at JoVE.com

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Vi erbjuder ett förbättrat protokoll för att extrahera hög molekylvikt DNA från hypersaline mikrobiella mattor. Mikrobiella celler är separerade från mattan matrisen före DNA-extraktion och rening. Detta ökar koncentrationen, kvalitet och storlek av DNA. Protokollet kan användas för andra eldfasta prover.

Utvinning av hög molekylvikt DNA från Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologi mikrobiella samhällen - Intervju

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA-extraktion från 0,22 mikroM Sterivex Filter och cesiumklorid densitetsgradient Centrifugering

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Utvinning av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mark och sediment

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

En hybrid-DNA Extraction Metod för kvalitativ och kvantitativ bedömning av bakteriella gemenskapernas från fjäderfäproduktion Prover

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucin agarosgelelektrofores: Western blotting för hög molekylvikt Glykoproteiner


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Framställning av formalinfixerade paraffininbäddade vävnads Cores för både RNA och DNA-extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Metoder för extraktion av endosymbioner från vitflyget<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Modifierade metoder för lastning av hög genomströmning DNA extraktionsplattor minska potential för kontaminering

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...