Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل فرع الإنجابية من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (معاهد الصحة القومية -- R21 HD059015) والتي H. تشارلز هود الطفل مؤسسة جائزة الباحث الشاب بحوث الصحية (بوسطن ، ماساتشوستس).

1. موقع الطفرات الموجهة للغاية GC - الغنية تسلسل الجينات KISS1R <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قالب : [كدنا] تسلسل الكامل للKISS1R الإنسان مع العلامة - Myc تنصهر في النهاية - N والخمسين. هو استنساخ هذا التسلسل في التعبير pCS2 ناقلات + ، وهو متوافق مع خطوط خلاي?...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54.">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li><li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).</li><li>Hall, R. A., George, S. R., O'Dowd, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).</li><li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors.">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li><li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

وقد استخدمت موقع الطفرات الموجهة لدراسة وظيفة البروتين من خلال إدخال تغييرات في تسلسل النوكليوتيدات ترميز الجينات المستهدفة على مدى ثلاثة عقود. وقد وصفت هذه التقنية الأصلي في عام 1978 من قبل الصيدلي البريطاني والكندي الحائز على جائزة نوبل مايكل سميث 10. المشتركة...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> 10X الحل PCRx محسن </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra البلمرة DNA عالية الدقة البديلة منظفات </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN - I </td><td> نيو إنجلاند Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10 الذهب E. Ultracompetent الخلايا القولونية </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 - CV </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> اتلانتا البيولوجية </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter ترنسفكأيشن الكاشف </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> مثبط البروتياز الكوكتيل وPMSF </td><td> سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية </td><td> SC - 24948 </td></tr><tr><td> بيرس الفحص البروتين BCA كيت </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> مكافحة Myc العلامة (استنساخ 4A6) agarose المتقارن </td><td> ميليبور </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2X تحميل العازلة </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> معيار تريس ، حمض الهيدروكلوريك الجاهزة هلام ، والانحدار 4-15 ٪ </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon - FL PVDF الغشاء </td><td> ميليبور </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> حظر مؤقت أوديسي </td><td> LI - COR العلوم البيولوجية </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للأجسام المضادة myc </td><td> إشارات الخلية </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> الماعز المضادة للأرنب IRDye 800CW </td><td> LI - COR العلوم البيولوجية </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء أوديسي </td><td> LI - COR العلوم البيولوجية </td><td></td></tr><tr><td> كوكتيل وقف المانع البروتياز (100X) </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

مستقبلات kisspeptin (KISS1R) هو مجموعة مستقبلات البروتين يقترن المعترف بها على الزناد من البلوغ ومنظم من الكفاءة التناسلية في مرحلة البلوغ 1،2،3. وقد ارتبطت طفرات في تعطيل KISS1R المحددة في المرضى الذين يعانون من ناقص موجهة الغدد التناسلية iodiopathic 1،2 (IHH) قصور الغدد التناسلية والبلوغ المبكر 4. الدراسات الفنية لهذه المسوخ حاسمة الأهمية بالنسبة لفهمنا للآليات الكامنة وراء تنظيم هذا الاستنساخ بواسطة مستقبلات فضلا عن تشكيل لنتائج المرض الذي ينجم عن إشارات KISS1R غير طبيعي وظيفة. ومع ذلك ، فإن تسلسل للغاية GC - الغنية من الجين KISS1R يجعل من الصعب أن أعرض بدلا الطفرات أو تضخيم هذا الجين الترميز بواسطة مستقبلات PCR. نحن هنا تصف طريقة لإدخال طفرات من الفائدة في هذا التسلسل للغاية GC - الغنية التي استخدمت بنجاح لتوليد أكثر من المسوخ KISS1R عشرة في المختبر لدينا. ونحن الأمثل لتسهيل ظروف PCR التضخيم من مجموعة من المسوخ التي تشمل استبدال KISS1R ، والحذف أو الإدراج في التسلسل KISS1R. إضافة إلى حل محسن PCR ، فضلا عن نسبة مئوية صغيرة من DMSO كانت مفيدة بشكل خاص لتحسين التضخيم. قد يكون هذا الإجراء مفيدا الأمثل لقوالب GC - الغنية الأخرى كذلك. واستخدمت ناقلات ترميز KISS1R التعبير لوصف الإشارات وظيفة هذا المستقبل من أجل أن نفهم كيف يمكن أن تغير KISS1R الطفرات وظيفة ، وتؤدي إلى الظواهر المرتبطة التناسلي. تبعا لذلك ، يمكن أن يتضح من التطبيقات المحتملة الناتجة عن المسوخ KISS1R الطفرات في الموقع من إخراج العديد من الدراسات 1،4،5،6،7،8. كمثال على ذلك ، وقد تبين الطفرة كسب من بين وظيفة في KISS1R (Arg386Pro) ، الذي يرتبط مع سن البلوغ المبكر ، إلى إطالة أمد استجابة لتحفيز مستقبلات يجند 4 وكذلك لتغيير معدل تدهور KISS1R 9 . ومن المثير للاهتمام ، والدراسات لدينا تشير إلى أن KISS1R هو المتدهورة التي proteasome ، في مقابل تدهور في الليزوزومية الكلاسيكية وصفها لمعظم مستقبلات البروتين يقترن G 9. في المثال المعروض هنا ، هو التحقيق تدهور KISS1R في خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة الجنين البشري - 293) معربا عن عابر Myc الموسومة KISS1R (MycKISS1R) وتعامل مع مثبطات proteasome أو يحلول. وimmunoprecipitated lysates الخلية باستخدام agarose - مترافق المضادة للأجسام المضادة myc يليه تحليل لطخة غربية. يتم إجراء الكشف النوعي والكمي لMycKISS1R على البقع باستخدام نظام أوديسي LI - COR الأشعة تحت الحمراء. قد يكون هذا النهج مفيدا في دراسة تدهور البروتينات الأخرى ذات الاهتمام كذلك.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

ترتبط طفرات في مستقبلات kisspeptin (KISS1R) يعانون من اضطرابات الإنجابية في المرضى. نحن هنا تصف كيفية إدخال طفرات مهمة في تسلسل القيادة العامة الغنية KISS1R فضلا عن استخدام بنيات KISS1R لتوصيف مسار تدهور بواسطة مستقبلات مناعي وصمة عار الغربية.

الطفرات وتحليل الطفرات الوراثية في تسلسل القيادة العامة الغنية مستقبلات KISS1 المحددة في البشر يعانون من اضطرابات الإنجابية

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

تصور المتغيرات الجينية وأهداف قصيرة والطفرات في سياق الأنسجة المورفولوجية الجيش النيبالي الملكي في الموقع تهجين المقايسة

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...