Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
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Ce travail a été partiellement financé par la Direction de la reproduction de l&#39;Institut national de la santé infantile et le développement humain (NICHD - R21 HD059015) et par la Charles H. Bois Fondation Enfant Young Investigator Award de recherche en santé (Boston, MA).

1. La mutagenèse dirigée de la séquence de gène très riches en GC KISS1R <ol><li> Modèle: pleine séquence d&#39;ADNc de l&#39;humain avec une KISS1R Myc-étiquette fusionnée à son extrémité N-terminale. Cette séquence est clonée dans le vecteur d&#39;expression pCS2 +, qui est compatible avec les lignées cellulaires de mammifères utilisée ensuite pour transfections. Ce vecteur d&#39;expression est appelé aux présentes pCS2 KISS1R + Myc. </li><li> Conception d&#39;amorce: ...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. 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C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. 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K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

La mutagenèse dirigée a été utilisée pour étudier la fonction des protéines par l&#39;introduction de changements de nucléotides dans la séquence codante des gènes cibles de plus de trois décennies. La technique originale a été décrite en 1978 par le chimiste britannique-canadien et lauréat du Prix Nobel Michael Smith 10. Michael Smith a partagé le Prix Nobel 1993 de chimie avec Kary Mullis, le biochimiste américain qui a inventé la Polymerase Chain Reaction (PCR) 11. La méthode ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra haute fidélité Détergent alternative ADN polymérase </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold Ultracompetent E. cellules coli </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 à 013-CV </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Réactif de transfection Geneporter </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la protéase cocktail et PMSF </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugué </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> Tampon de charge 2x </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Critère de Tris-HCl préfabriqué gel gradient 4-15% </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL membrane PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Tampon de blocage Odyssey </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Lapin d&#39;anticorps anti-myc </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-lapin IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Imagerie infrarouge Odyssey système </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de protéase Halt (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Le récepteur kisspeptine (KISS1R) est un G récepteurs couplés aux protéines reconnu comme l&#39;élément déclencheur de la puberté et un régulateur de la compétence de reproduction à l&#39;âge adulte 1,2,3. Mutations d&#39;inactivation dans KISS1R identifiées chez des patients ont été associés à un hypogonadisme hypogonadotrophique iodiopathic (IHH) 1,2 et une puberté précoce 4. Les études fonctionnelles de ces mutants sont cruciaux pour notre compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de la reproduction par ce récepteur ainsi que ceux qui façonnent les résultats des maladies qui résultent de la signalisation KISS1R anormale et la fonction. Cependant, la séquence très riches en GC du gène KISS1R rend plutôt difficile d&#39;introduire ou d&#39;amplifier les mutations du gène codant pour ce récepteur par PCR. Nous décrivons ici une méthode pour introduire des mutations de l&#39;intérêt dans cette séquence très riches en GC qui a été utilisée avec succès pour générer plus d&#39;un douzaine de mutants KISS1R dans notre laboratoire. Nous avons optimisé les conditions de PCR afin de faciliter l&#39;amplification d&#39;une gamme de mutants KISS1R qui incluent substitutions, délétions ou des insertions dans la séquence KISS1R. L&#39;ajout d&#39;une solution de PCR Enhancer, ainsi que d&#39;un faible pourcentage de DMSO ont été particulièrement utiles pour améliorer l&#39;amplification. Cette procédure optimisée peut être utile pour d&#39;autres riches en GC modèles ainsi. Le vecteur d&#39;expression codant pour la KISS1R est été utilisée pour caractériser la signalisation et la fonction de ce récepteur afin de comprendre comment les mutations peuvent modifier KISS1R fonction et conduire à la reproduction phénotypes associés. En conséquence, les applications potentielles de mutants générés par KISS1R mutagenèse dirigée peut être illustrée par de nombreuses études 1,4,5,6,7,8. À titre d&#39;exemple, la mutation gain-de-fonction dans le KISS1R (Arg386Pro), qui est associée à la puberté précoce, a montré une prolongation de la réactivité du récepteur à 4 stimulation de ligand ainsi que de modifier le taux de dégradation des KISS1R 9 . Fait intéressant, nos études indiquent que KISS1R est dégradée par le protéasome, par opposition à la dégradation lysosomale classiques décrites pour la plupart G récepteurs couplés aux protéines 9. Dans l&#39;exemple présenté ici, la dégradation de l&#39;KISS1R est étudiée dans cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293) exprimant de manière transitoire Myc-taggés KISS1R (MycKISS1R) et traités avec des inhibiteurs du protéasome ou lysosome. Les lysats cellulaires sont immunoprécipitées en utilisant une agarose conjugué d&#39;anticorps anti-myc suivie par une analyse Western blot. Détection et quantification des MycKISS1R sur des transferts est effectuée en utilisant le système Odyssey infrarouge LI-COR. Cette approche peut être utile dans l&#39;étude de la dégradation d&#39;autres protéines d&#39;intérêt aussi bien.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Des mutations dans le récepteur kisspeptine (KISS1R) sont associés à des troubles de la reproduction chez les patients. Nous décrivons ici comment introduire des mutations d&#39;intérêt dans la séquence riches en GC d&#39;KISS1R ainsi que l&#39;utilisation de constructions KISS1R de caractériser la voie de dégradation du récepteur par immunoprécipitation et Western blot

Mutagenèse et d&#39;analyse des mutations génétiques dans la séquence riches en GC récepteur KISS1 identifiés chez l&#39;homme souffrant de troubles de la reproduction

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

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