Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
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Und von der Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA) - Diese Arbeit wurde teilweise durch die Reproduktionsmedizin Abteilung der National Institute of Child Health and Human Development (R21 HD059015 NICHD) finanziert.

1. Die ortsspezifische Mutagenese von hoch GC-reiche KISS1R Gensequenz <ol><li> Vorlage: volle cDNA-Sequenz des menschlichen KISS1R mit einem Myc-tag fusioniert an seinem N-Terminus. Diese Sequenz wird in die pCS2 + Expressionsvektor, der kompatibel mit dem Säugerzelllinien anschließend für Transfektionen verwendet wird geklont. Dieser Expressionsvektor wird hier als pCS2 + Myc KISS1R bezeichnet. </li><li> Primer-Design: Primer sind so konzipiert, gewünschten Mutationen tragen, nach de...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. 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C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. 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K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

Die ortsspezifische Mutagenese wurde verwendet, um Protein-Funktion durch die Einführung von Nukleotid-Veränderungen in der kodierenden Sequenz von gezielten Gene für mehr als drei Jahrzehnten zu studieren. Die ursprüngliche Technik wurde 1978 von dem britisch-kanadische Chemiker und Nobelpreisträger Michael Smith 10 beschrieben. Michael Smith gemeinsam die 1993 den Nobelpreis für Chemie mit Kary Mullis, der amerikanische Biochemiker, der die Polymerase Chain Reaction (PCR) 11 erfunden. Die u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Alternative Reinigungsmittel </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold Ultracompetent E. coli-Zellen </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10 bis 013-CV </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Transfektionsreagenz </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail und PMSF </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc-Tag (Klon 4A6) Agarose-Konjugat </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x Ladepuffer </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Criterion Tris-HCl Fertigteil-Gel, 4-15% Steigung </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL PVDF-Membran </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Rabbit anti-myc-Antikörper </td><td> Zelluläre Signale </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Ziege Anti-Kaninchen-IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Odyssey Imaging Infrared Systems </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Die kisspeptin Rezeptor (KISS1R) ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor als Auslöser der Pubertät und ein Regulator des reproduktiven Kompetenz im Erwachsenenalter 1,2,3 anerkannt. Inaktivierende Mutationen in KISS1R bei Patienten identifiziert haben mit iodiopathic Hypogonadismus (IHH) 1,2 und vorzeitiger Pubertät 4 wurde verbunden. Funktionelle Untersuchungen dieser Mutanten sind entscheidend für unser Verständnis der Mechanismen der Regulation der Fortpflanzung durch diesen Rezeptor als auch die Gestaltung der Krankheitsverläufe, die sich aus abnormen KISS1R Signalisierung und Funktion. Allerdings macht der hohe GC-reiche Sequenz des Gens KISS1R es ziemlich schwierig zu Mutationen einzuführen oder zu verstärken Gen für diesen Rezeptor durch PCR. Hier beschreiben wir eine Methode, um Mutationen von Interesse in diesem sehr GC-reiche Sequenz, die verwendet wurde erfolgreich zu generieren mehr als ein Dutzend KISS1R Mutanten in unserem Labor einzuführen. Wir haben die PCR-Bedingungen optimiert, um die Verstärkung von einer Reihe von KISS1R Mutanten, die Substitutionen, Deletionen oder Insertionen in der KISS1R Sequenz enthalten erleichtern. Die Zugabe eines PCR-Enhancer-Lösung, sowie ein kleiner Prozentsatz von DMSO wurden besonders hilfreich, um Verstärkung zu verbessern. Dieses optimierte Verfahren kann sinnvoll sein, für andere GC-reiche Templates als auch. Der Expressionsvektor kodiert KISS1R ist benutzt worden, um Signalisierung und Funktion dieses Rezeptors zu charakterisieren, um zu verstehen, wie Mutationen können KISS1R Funktion zu ändern und zu den damit verbundenen reproduktiven Phänotypen. Dementsprechend können mögliche Anwendungen KISS1R Mutanten durch Mutagenese erzeugt durch viele Studien 1,4,5,6,7,8 dargestellt werden. Als Beispiel hat das gain-of-function-Mutation in der KISS1R (Arg386Pro), die mit vorzeitiger Pubertät verbunden ist, gezeigt worden, um die Reaktionsfähigkeit des Rezeptors an Ligand Stimulation 4 sowie zu verlängern, um die Geschwindigkeit des Abbaus von KISS1R 9 verändern . Interessanterweise zeigen unsere Studien, dass KISS1R durch das Proteasom degradiert wird, im Gegensatz zu den klassischen lysosomalen Abbau für die meisten G-Protein gekoppelte Rezeptoren 9 beschrieben entgegen. In dem hier vorgestellten Beispiel wird der Abbau der KISS1R in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) transient exprimierenden Myc-markierten KISS1R (MycKISS1R) untersucht und behandelt mit Proteasom-Inhibitoren oder Lysosom. Zelllysate werden immunpräzipitiert mit einem Agarose-konjugierten anti-myc-Antikörper durch Western-Blot-Analyse. Detektion und Quantifizierung von MycKISS1R auf Blots erfolgt mit dem LI-COR Odyssey Infrarot-System. Dieser Ansatz kann in der Studie der Abbau anderer Proteine ​​von Interesse als auch nützlich.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Mutationen in den kisspeptin Rezeptor (KISS1R) sind mit reproduktiven Störungen bei Patienten assoziiert. Hier beschreiben wir, wie Mutationen der Interesse an der GC-reiche Sequenz von KISS1R sowie die Verwendung von KISS1R Konstrukte einzuführen, um die Abbauweg des Rezeptors durch Immunpräzipitation und Western-Blot charakterisieren

Mutagenese und Analyse von genetischen Mutationen in den GC-reichen KISS1 Rezeptor-Sequenz in Menschen mit Fortpflanzungsstörungen Identified

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Forschung

Biologie

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...