Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
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とチャールズHフード財団若手研究者母子保健研究賞（ボストン、マサチューセッツ州）によって - この作品の一部は国立小児保健発育研究所（R21 HD059015 NICHD）の生殖支店によって資金を供給された。

1。非常にGC -リッチなKISS1Rの遺伝子配列の部位特異的変異誘発<ol><li>テンプレート：そのN末端に融合させたMycタグとの人間KISS1Rの完全なcDNA配列。このシーケンスは、その後、トランスフェクションに使用される哺乳動物細胞株との互換性があるpCS2 +発現ベクターにクローニングされています。この発現ベクターは、pCS2 + MycのKISS1Rと称する。 </li><li>プライマーの設計プ...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54.">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li><li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).</li><li>Hall, R. A., George, S. R., O'Dowd, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).</li><li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors.">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li><li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

部位特異的突然変異誘発法は、30年以上を対象とした遺伝子のコーディング配列でヌクレオチド変化を導入することによって、蛋白質機能を研究するために使用されています。オリジナルの技術は、英国、カナダの化学者、ノーベル賞受賞者のマイケルスミス10で1978年に記述されていた。マイケルスミスはケイリーンマリス、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）11を発明したアメリ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 10倍PCRxエンハンサーソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra高忠実度DNAポリメラーゼの代替洗浄剤</td><td>ストラタジーン</td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN - I </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10 - GoldをUltracompetent E.大腸菌細胞 </td><td>ストラタジーン</td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10から013 - CV </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporterトランスフェクション試薬</td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>カルビオケム</td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td>カルビオケム</td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td>アンビオン</td><td> AM9625 </td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテルとPMSF </td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 24948 </td></tr><tr><td>ピアスBCAタンパク質アッセイキット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 23225 </td></tr><tr><td>抗Mycタグ（クローン4A6）アガロース抱合体</td><td>ミリポア</td><td> 16から219 </td></tr><tr><td> 2倍のローディングバッファー</td><td> BioRad社</td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td>基準のトリス- HClプレキャストゲル、4-15％の勾配</td><td> BioRad社</td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td>イモビロン- FL PVDF膜</td><td>ミリポア</td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td>オデッセイブロッキングバッファー</td><td> LI - COR Biosciences社</td><td> 927から40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad社</td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td>ウサギ抗myc抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td> 2272 </td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIRDye 800CW </td><td> LI - COR Biosciences社</td><td> 926から32211 </td></tr><tr><td>オデッセイイメージング赤外線システム</td><td> LI - COR Biosciences社</td><td></td></tr><tr><td>停止のプロテアーゼインヒビターカクテル（100倍） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

キスペプチン受容体（KISS1R）は思春期の引き金と成人1,2,3の生殖能力の調節因子として認識され、Gタンパク質共役型受容体です。患者で同定KISS1Rの不活性化変異がiodiopathic低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（IHH）1,2と思春期早発症4に関連している。これらの変異体の機能的研究は、この受容体による生殖の調節だけでなく、病気の結果を整形したものと、結果は異常KISS1Rシグナリングと機能からの根底にあるメカニズムの理解にとってきわめて重要である。しかし、KISS1Rの遺伝子の高度にGC -リッチ配列は、それはかなり困難な突然変異を導入またはPCRによってこの受容体をコードする遺伝子を増幅することができます。 ここでは、我々の研究室で十数KISS1R変異体を介して生成するために正常に使用されているこの非常にGCリッチな配列に興味の変異を導入する方法を説明します。我々はKISS1Rシーケンスで置換、欠失又は挿入を含むKISS1R変異体の範囲の増幅を促進するためのPCR条件を最適化してきました。 PCRエンハンサー溶液の添加は、同様にDMSOのわずかな割合のような増幅を向上させるために特に有用であった。この最適化された手順は、他のGCリッチなテンプレートの役に立つかもしれません。 KISS1Rをコードする発現ベクターは、変異がKISS1R機能を変更すると関連する生殖表現型に導く方法を理解するために、この受容体のシグナル伝達と機能を特徴付けるために使用されています。従って、部位特異的突然変異誘発により生成されたKISS1R変異体の潜在的なアプリケーションは、多くの研究1,4,5,6,7,8によって説明することができます。例として、思春期早発症に関連付けられているKISS1R（Arg386Pro）、、の機能獲得型変異はKISS1R 9の分解速度を変化させるリガンド刺激4と同様に受容体の応答性を延長することが示されている。興味深いことに、我々の研究は、ほとんどのGタンパク質共役受容体9のために説明古典リソソーム分解するのではなく、KISS1Rはプロテアソームにより分解されることを示している。ここで紹介する例では、KISS1Rの劣化は、一時的にmycタグKISS1R（MycKISS1R）を発現するヒト胎児腎臓細胞（HEK - 293）で検討されており、プロテアソームやリソソーム阻害剤で処理した。細胞溶解物をウェスタンブロット分析に続いてアガロース結合抗- myc抗体を用いて免疫沈降している。ブロット上MycKISS1Rの検出および定量は、LI - CORのオデッセイ赤外線システムを使用して実行されます。このアプローチでは、同様に関心のある他のタンパク質の分解の研究に有用である。

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

キスペプチン受容体（KISS1R）の変異は患者の生殖障害に関連付けられています。ここでは、免疫沈降とウェスタンブロットによる受容体の分解経路を特徴づけるためにKISS1RのGC -リッチ配列と同様にKISS1Rの構文の使用に関心の突然変異を導入する方法について説明します。

生殖障害を持つヒトで同定されたGC -リッチなKISS1受容体配列の遺伝的変異の変異導入と解析

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

遺伝的変異、短期目標と交配試験場でRNA の形態学的組織コンテキストに点突然変異を可視化

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...