Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Poder Reprodutiva do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD - R21 HD059015) e pela capa Charles H. Young Foundation Investigator Award Criança Pesquisa em Saúde (Boston, MA).

1. Sítio-dirigida mutagênese da seqüência altamente GC-rica gene KISS1R <ol><li> Modelo: seqüência de cDNA completo do KISS1R humano com uma tag-Myc fundida ao seu N-terminal. Esta seqüência é clonado no vetor de expressão pCS2 +, que é compatível com as linhas de células de mamíferos posteriormente utilizado para transfections. Este vetor de expressão é aqui referida como pCS2 + Myc KISS1R. </li><li> Desenho de primers: primers são projetados para transportar mutações d...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. 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K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

Sítio-dirigida mutagênese tem sido utilizado para estudar a função de proteínas através da introdução de mudanças de nucleotídeos na seqüência de codificação de genes alvo por mais de três décadas. A técnica original foi descrita em 1978 pelo químico britânico-canadense e Prêmio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith dividiram o Prêmio Nobel de 1993 em Química com Kary Mullis, o bioquímico americano que inventou o Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 11. O método original d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 10x PCRx Solução Enhancer </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra alta fidelidade DNA polimerase Detergente Alternativa </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold E. Ultracompetent células de Escherichia </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Reagente Transfection </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Inibidor de protease PMSF e cocktail </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugado </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x de tampão de carregamento </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Critério de Tris-HCl precast gel, gradiente de 4-15% </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL membrana PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Tampão de bloqueio Odyssey </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Anticorpos anti-myc coelho </td><td> Sinalização celular </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Cabra anti-coelho IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Odyssey Infrared Imaging System </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Halt Cocktail inibidor da protease (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

O receptor kisspeptina (KISS1R) é um receptor acoplado à proteína G reconhecido como o gatilho da puberdade e um regulador de competência reprodutiva na vida adulta 1,2,3. Mutações inativadoras no KISS1R identificados em pacientes têm sido associados com hipogonadismo hipogonadotrófico iodiopathic 1,2 (IHH) e puberdade precoce 4. Estudos funcionais destes mutantes são cruciais para nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação da reprodução por este receptor, bem como aqueles moldar a evolução das doenças, que resultam de sinalização KISS1R anormal e função. No entanto, a seqüência altamente GC-rica do gene KISS1R torna bastante difícil a introdução de mutações ou amplificar o gene que codifica este receptor pela PCR. Aqui nós descrevemos um método para introduzir mutações de interesse para esta seqüência altamente GC-rica que tem sido utilizado com sucesso para gerar mais de uma dúzia de mutantes KISS1R em nosso laboratório. Nós otimizamos as condições de PCR para facilitar a ampliação de uma série de mutantes KISS1R que incluem substituições, supressões ou inserções na seqüência KISS1R. A adição de uma solução enhancer PCR, bem como de uma pequena porcentagem de DMSO foram especialmente úteis para melhorar a amplificação. Este procedimento otimizado pode ser útil para outras GC-rica modelos também. O vetor de expressão que codifica a KISS1R está sendo usado para caracterizar a sinalização e função desse receptor, a fim de entender como as mutações podem mudar KISS1R função e levar a fenótipos associados reprodutiva. Assim, as aplicações potenciais de mutantes KISS1R gerados por mutagênese sítio-dirigida pode ser ilustrado por muitos estudos 1,4,5,6,7,8. Como exemplo, a mutação de ganho de função-nos KISS1R (Arg386Pro), que está associada com puberdade precoce, foi mostrado para prolongar a capacidade de resposta do receptor à estimulação ligante 4, bem como de alterar a taxa de degradação da KISS1R 9 . Curiosamente, nossos estudos indicam que KISS1R é degradada pelo proteassoma, em oposição à degradação lisossomal clássico descrito para a maioria das proteínas G-coupled receptors 9. No exemplo aqui apresentado, a degradação do KISS1R é investigada em células embrionárias do rim (HEK-293) transitoriamente expressando-Myc tag KISS1R (MycKISS1R) e tratados com inibidores de proteassoma ou lisossomos. Lisados ​​celulares são immunoprecipitated agarose usando um conjugado anticorpo anti-myc seguido de western blot. Detecção e quantificação de MycKISS1R em blots é realizada utilizando o Sistema Odyssey LI-COR Infrared. Esta abordagem pode ser útil no estudo da degradação de outras proteínas de interesse também.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Mutações no receptor kisspeptina (KISS1R) estão associados com distúrbios reprodutivos em pacientes. Aqui nós descrevemos como introduzir mutações de interesse na seqüência GC-rica de KISS1R, bem como o uso de construções KISS1R para caracterizar a via de degradação do receptor por imunoprecipitação e western blot

Mutagênese e análise de mutações genéticas nos receptores de Seqüência GC-rica KISS1 identificados em humanos com distúrbios reprodutivos

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biologia

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Culturas alternativas para produção, manutenção e análise genética de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualização de variantes genéticas, metas de curtas e mutações pontuais no contexto morfológico do tecido com um ensaio de RNA In Situ da hibridação

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...