Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

Эта работа частично финансировалась Репродуктивное отделения Национального института детского здоровья и человеческого развития (NICHD - R21 HD059015) и Чарльз Х. Худа Фонд молодых следователь ребенка исследованиям в области здравоохранения премию (Бостон, Массачусетс).

1. Сайт-направленный мутагенез высоко GC-богатых последовательностей гена KISS1R <ol><li> Шаблон: полная кДНК последовательность человека KISS1R с Myc-теги, слитый с его N-конца. Эта последовательность клонировали в выражении pCS2 + вектор, который совместим с клеточных линий млекопитающих зате...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54.">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li><li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).</li><li>Hall, R. A., George, S. R., O'Dowd, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).</li><li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors.">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li><li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

Сайт-направленный мутагенез был использован для исследования функции белка, вводя изменения в нуклеотидной последовательности, кодирующей целевых генов на протяжении более трех десятилетий. Оригинальная методика была описана в 1978 году англо-канадского химик, лауреат Нобелевской пр?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer решения </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra Высококачественное ДНК-полимераза Альтернативные моющих средств </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> ДПН-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold Ultracompetent Е. кишечной клетки </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td></tr><tr><td> Фетальной телячьей сыворотки </td><td> Атланты биологические </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Трансфекция реагент </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Амбион </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Ингибитор протеазы коктейль и PMSF </td><td> Санта-Крус биотехнологии </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Пирс BCA белка Пробирной Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> анти-Myc теги (клон 4A6) агарозном сопряженных </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x загрузки буфера </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Критерий Трис-HCl сборных гель, 4-15% градиент </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-ФЗ PVDF мембраны </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Одиссея блокирующего буфера </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Кролик анти-Myc антител </td><td> Сотовые сигнализации </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Коза анти-кролик IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Одиссея изображений Инфракрасная </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Остановить ингибитор протеазы коктейль (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Kisspeptin рецепторов (KISS1R) является G-белком рецептор признан курок полового созревания и регулятором репродуктивной компетенции в зрелом возрасте 1,2,3. Инактивирующих мутаций в KISS1R идентифицированы у пациентов были связаны с iodiopathic гипогонадотропный гипогонадизм (IHH) 1,2 и преждевременным половым созреванием 4. Функциональные исследования этих мутантов имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в регуляции размножения этим рецептором, а также теми, кто определяет болезнь результаты, которые получаются в результате ненормального сигнализации KISS1R и функции. Тем не менее, высоко GC-богатые последовательности гена KISS1R делает его довольно трудно представить мутации или усиливать ген, кодирующий этот рецептор с помощью ПЦР. Здесь мы опишем метод введения мутаций интерес в этой весьма GC-богатые последовательности, которые были успешно использованы для создания более десятка KISS1R мутантов в нашей лаборатории. Мы оптимизировали ПЦР условия для облегчения усиления спектр KISS1R мутантов, которые включают замены, делеции или вставки в последовательности KISS1R. Помимо решения ПЦР усилитель, а также небольшой процент ДМСО были особенно полезны для улучшения усиления. Такая оптимизированная процедура может быть полезным для других GC-богатых шаблонов, а также. Выражение вектора, кодирующего KISS1R это использовалось для характеристики сигнализации и функции этого рецептора для того, чтобы понять, как мутации могут менять KISS1R функции и привести к репродуктивным связанных фенотипов. Соответственно, возможности применения KISS1R мутантов порожденных сайт-направленного мутагенеза можно проиллюстрировать многими исследованиями 1,4,5,6,7,8. Как, например, получить-функции мутации в KISS1R (Arg386Pro), что связано с преждевременным половым созреванием, как было показано, чтобы продлить реагирования рецептора лиганда стимуляции 4, а также изменять скорость деградации KISS1R 9 . Интересно, что наши исследования показывают, что KISS1R разлагается под протеасомы, в отличие от классического лизосомальных деградации описаны для большинства G-белком рецепторы 9. В примере, приведенном здесь, деградация KISS1R исследуется в человеческих эмбриональных клеток почки (HEK-293) временно выражения Myc с метками KISS1R (MycKISS1R) и обрабатывают протеасом или лизосомы ингибиторов. Сотовые лизатов являются иммунопреципитации использованием агарозы-сопряженных анти-Myc антител с последующим анализом пятно западной. Обнаружение и количественное определение MycKISS1R на пятна осуществляется с помощью LI-COR Odyssey Инфракрасная система. Такой подход может быть полезным при изучении деградации других белков интерес.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Мутации в kisspeptin рецепторов (KISS1R) связаны с репродуктивные расстройства у больных. Здесь мы опишем, как ввести мутации интереса к GC-богатые последовательности KISS1R, а также использование конструкций KISS1R охарактеризовать путь деградации рецептора иммунопреципитации и иммуноблоттинга

Мутагенеза и анализа генетических мутаций в GC-богатых KISS1 рецепторов Последовательность Выявленные у людей с репродуктивным расстройствам

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Генетические и биохимические подходы к<em&gt; В Vivo</em&gt; и<em&gt; In Vitro</em&gt; Оценка белка олигомеризации: The Рианодин Рецептор Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Визуализация генетических вариантов, короткие цели и точечные мутации в контексте морфологических ткани с РНК в Situ гибридизация Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...