Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
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Este trabajo fue financiado parcialmente por el Poder Reproductiva del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD - R21 HD059015) y el Premio Charles H. Hood Foundation Niño Pequeño Investigador Investigación en Salud (Boston, MA).

1. Mutagénesis dirigida de secuencia altamente rica en GC gen KISS1R <ol><li> Plantilla: secuencia completa de ADNc de la KISS1R humanos con Myc-tag fusionada a su extremo N-terminal. Esta secuencia se clonó en el vector de expresión pCS2 +, que es compatible con las líneas de células de mamíferos utilizan posteriormente para la transfección. Este vector de expresión se hace referencia en este documento como pCS2 KISS1R + Myc. </li><li> Diseño de la cartilla: primers están diseñ...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. 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K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

Mutagénesis dirigida se ha utilizado para estudiar la función de proteínas mediante la introducción de cambios de nucleótidos en la secuencia de codificación de los genes blanco de más de tres décadas. La técnica original fue descrita en 1978 por el químico británico-canadiense y ganador del Premio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith compartió el 1993 Premio Nobel de Química con Kary Mullis, el bioquímico estadounidense que inventó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 11. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 10x PCRx Reforzador Solución </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra de alta fidelidad de la polimerasa de ADN Alternativa detergente </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold Ultracompetent E. células de E. coli </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 013 CV </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Transfection Reagent </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Cóctel de inhibidores de la proteasa y PMSF </td><td> Santa Cruz de Biotecnología </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Kit de ensayo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc etiqueta (clon 4A6) de agarosa conjugada </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x tampón de carga </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Criterio de Tris-HCl prefabricados gel, 4.15% de gradiente </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL membrana de PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Odyssey tampón de bloqueo </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Conejo anti-myc anticuerpos </td><td> Señalización celular </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Cabra anti-conejo IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Imagen infrarroja del sistema Odyssey </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Proteasa Inhibidor de detener Cocktail (100 veces) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

El receptor de kisspeptina (KISS1R) es una proteína G-receptor acoplado reconocido como el desencadenante de la pubertad y un regulador de la competencia reproductiva en la edad adulta 1,2,3. Inactivación de las mutaciones en KISS1R identificados en los pacientes han sido asociados con el hipogonadismo hipogonadotrópico iodiopathic (IHH) 1,2 y la pubertad precoz 4. Estudios funcionales de estos mutantes son cruciales para nuestra comprensión de los mecanismos que subyacen a la regulación de la reproducción de este receptor, así como los que dan forma los resultados de la enfermedad, que resultan de la señalización KISS1R anormal y la función. Sin embargo, la secuencia altamente rica en GC del gen KISS1R hace que sea bastante difícil de introducir mutaciones o amplificar el gen que codifica este receptor por PCR. Aquí se describe un método para introducir mutaciones de interés en esta secuencia muy rica en GC que ha sido utilizado con éxito para generar más de una docena de mutantes KISS1R en nuestro laboratorio. Hemos optimizado las condiciones de PCR para facilitar la ampliación de una serie de mutantes KISS1R que incluyen sustituciones, eliminaciones o inserciones en la secuencia KISS1R. La adición de una solución de PCR potenciador, así como de un pequeño porcentaje de DMSO fueron especialmente útiles para mejorar la amplificación. Este procedimiento optimizado puede ser útil para otros GC-ricos y plantillas. El vector de expresión que codifica la KISS1R se ha utilizado para caracterizar la señalización y la función de este receptor con el fin de entender cómo las mutaciones pueden cambiar KISS1R función y llevar a los fenotipos asociados reproductiva. En consecuencia, las posibles aplicaciones de los mutantes KISS1R generado por mutagénesis dirigida se puede ilustrar con muchos estudios 1,4,5,6,7,8. A modo de ejemplo, la mutación de ganancia de función en el KISS1R (Arg386Pro), que está asociada con la pubertad precoz, se ha demostrado que prolonga la capacidad de respuesta del receptor a la estimulación ligando 4, así como para alterar la velocidad de degradación de KISS1R 9 . Curiosamente, nuestros estudios indican que KISS1R se degrada por el proteasoma, a diferencia de la degradación lisosomal clásicos descritos para la mayoría de G receptores acoplados a proteínas 9. En el ejemplo que aquí se presenta, la degradación de la KISS1R se investiga en células de riñón embrionario humano (HEK-293) que expresan transitoriamente Myc-etiquetados KISS1R (MycKISS1R) y tratados con inhibidores del proteasoma o lisosomas. Lisados ​​celulares se immunoprecipitated agarosa usando un conjugado de anticuerpos anti-myc seguido por análisis de Western blot. Detección y cuantificación de MycKISS1R en transferencias se realiza mediante el sistema Odyssey LI-COR infrarrojos. Este enfoque puede ser útil en el estudio de la degradación de otras proteínas de interés.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Las mutaciones en el receptor kisspeptina (KISS1R) se asocian con trastornos de la reproducción en los pacientes. A continuación se describe la forma de introducir las mutaciones de interés en la secuencia rica en GC de KISS1R, así como el uso de construcciones KISS1R para caracterizar la vía de degradación del receptor por inmunoprecipitación y Western Blot

Mutagénesis y análisis de mutaciones genéticas en la secuencia del receptor GC-ricos KISS1 identificado en el hombre con Trastornos del aparato reproductor

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