Name: mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

Detta arbete har delvis finansierats av reproduktiv förgrena sig av det nationella institutet för barns hälsa och mänsklig utveckling (NICHD - K21 HD059015) och av Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA).

1. Site-directed mutagenes av högt GC-rika KISS1R gensekvens <ol><li> Mall: fullständig cDNA sekvensen av människans KISS1R med Myc-tag smält till dess N-terminus. Denna sekvens är klonad i pCS2 + uttrycket vektor, som är kompatibel med däggdjur cellinjer därefter används för transfections. Detta uttryck vektorn är i kallad pCS2 + Myc KISS1R. </li><li> Primer design: grundfärger avsedda för önskad mutationer, enligt anvisningarna i QuikChange Site-Directed Mutagenes kit (Stra...

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54.">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li><li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).</li><li>Hall, R. A., George, S. R., O'Dowd, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).</li><li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors.">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li><li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

Site-directed mutagenes har använts för att studera proteiners funktion genom att införa nukleotid förändringar i kodande sekvens av riktade gener i över tre decennier. Den ursprungliga tekniken beskrevs 1978 av den brittisk-kanadensiska kemist och nobelpristagaren Michael Smith 10. Michael Smith delade 1993 Nobelpriset i kemi med Kary Mullis, den amerikanska Biokemisten som uppfann polymeraskedjereaktion (PCR) 11. Den ursprungliga metod som beskrivs av Michael Smith har förbättrats under ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 52.391 </td></tr><tr><td> PfuUltra High-fidelity DNA-polymeras Alternativa tvättmedel </td><td> Stratagene </td><td> 600.385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Guld Ultracompetent E. coli-celler </td><td> Stratagene </td><td> 200.314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td></tr><tr><td> Fostrets bovint serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Transfektion Reagens </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Calbiochem </td><td> 108.975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47.491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Proteashämmare cocktail och PMSF </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> Sc-24.948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23.225 </td></tr><tr><td> anti-Myc tagg (klon 4A6) agaros konjugat </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x buffert </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Kriterium Tris-HCl prefabricerade gel, 4-15% lutning </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL PVDF membran </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Odyssey blockerande buffert </td><td> LI-COR biovetenskaper </td><td> 927-40.000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Kanin anti-Myc antikropp </td><td> Cellsignalering </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Get-anti-kanin IRDye 800CW </td><td> LI-COR biovetenskaper </td><td> 926-32.211 </td></tr><tr><td> Odyssey Imaging infraröda systemet </td><td> LI-COR biovetenskaper </td><td></td></tr><tr><td> Halt Proteashämmare Cocktail (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78.430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Den kisspeptin receptor (KISS1R) är en G-proteinkopplade receptor erkänd som utlöser av puberteten och en regulator av reproduktiv kompetens i vuxen ålder 1,2,3. Inaktiverande mutationer i KISS1R identifierats hos patienter som har förknippats med iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 och tidig pubertet 4. Funktionella studier av dessa mutanter är avgörande för vår förståelse av mekanismerna bakom regleringen av reproduktionen av denna receptor samt de forma sjukdomsföljder, till följd av onormala KISS1R signalering och funktion. Men gör den mycket GC-rika sekvensen av KISS1R genen det ganska svårt att införa mutationer eller förstärka kodar denna receptor med PCR. Här beskriver vi en metod för att introducera mutationer av intresse i denna mycket GC-rika sekvens som har använts framgångsrikt för att generera mer än en mutanter dussin KISS1R i vårt laboratorium. Vi har optimerat PCR-förhållanden för att underlätta förstärkningen av en rad KISS1R mutanter som inkluderar ersätta, stryka eller införanden i KISS1R sekvens. Tillägget av en PCR-förstärkare lösning, samt en liten del av DMSO var speciellt användbart för att förbättra förstärkning. Detta optimerade proceduren kan vara användbar för andra GC-rika mallar också. Uttrycket Vektorn kodar för KISS1R är använts för att karaktärisera signalering och funktion av denna receptor för att förstå hur mutationer kan ändra KISS1R funktion och leda till tillhörande reproduktiva fenotyper. Därför kan potentiella tillämpningar KISS1R mutanter som genereras av plats riktad mutagenes kan illustreras av många studier 1,4,5,6,7,8. Som ett exempel har gain-of-funktion mutation i KISS1R (Arg386Pro), som är förknippade med tidig pubertet, har visats förlänga lyhördhet av receptorn till ligand stimulering 4 samt ändra nedbrytningshastigheten hos KISS1R 9 . Intressant, våra studier visar att KISS1R bryts ned av proteasom, i motsats till den klassiska lysosomalt nedbrytning beskrivs för de flesta G-proteinkopplade receptorer 9. I exemplet som presenteras här är nedbrytning av KISS1R undersökts i humana embryonala njur celler (HEK-293) övergående uttrycker Myc-märkta KISS1R (MycKISS1R) och behandlas med proteasom eller lysosome hämmare. Cell lysates är immunoprecipitated med en agaros-konjugerat anti-Myc antikropp följt av Western Blot analys. Påvisande och kvantifiering av MycKISS1R på blots utförs med hjälp av LI-COR Odyssey IR System. Denna metod kan vara användbar i studiet av nedbrytning av andra proteiner av intresse också.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Mutationer i kisspeptin receptorn (KISS1R) är associerade med reproduktionsstörningar hos patienter. Här beskriver vi hur man kan införa mutationer av intresse för GC-rika sekvens av KISS1R samt användning av KISS1R konstruktioner att karakterisera nedbrytningsvägen av receptorn genom immunoprecipitation och Western Blot

Mutagenes och analys av genetiska mutationer i GC-rika KISS1 Receptor Sekvens identifierats hos människa med störningar i fortplantningsorganen

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternativa kulturer för Human pluripotenta stamceller Produktion, underhåll, samt genetisk analys

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetiska och biokemiska metoder för<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; In Vitro</em&gt; Bedömning av Protein Oligomerisering: ryanodin Receptor Fallstudie

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Visualisera genetiska varianter, kort mål och punktmutationer i morfologiska vävnad med en RNA In Situ hybridisering analys

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...