Name: measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells at JoVE.com

ويدعم YS - T من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ، ومؤسسة العلوم اسرائيل (ISF) (250/06) وقوى الأمن الداخلي Bikura ، صندوق أبحاث السرطان في إسرائيل (ICRF) والألمانية الإسرائيلية مؤسسة للبحوث العلمية والتنمية (GIF ) ، الولايات المتحدة الأمريكية وإسرائيل مؤسسة العلوم ثنائية القومية (BSF) ، والألمانية الإسرائيلية مشروع التعاون (DIP) ، والوزارات الإسرائيلية للعلوم والصحة ، وأسرة جين Lebell ستيرن زميل في علوم الحياة في جامعة بار ايلان. YB ممتن للمؤسسة أزريلي لنيل الجائزة لزمالة أزريلي.

يجب أن تستخدم نظام خلية تحتوي على جينات بناء متكامل يتضمن تكرار متواليات MS2 لوضع علامات على مرنا في الخلايا الحية. في هذا البروتوكول نستخدم خلايا بشرية U2OS خط ايواء ستابلي متكاملة β - أكتين الجين ، وهذا هو fluorescently المسمى في الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، و?...

<ol>
	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. I., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+in+living+color.">RNA polymerase II transcription in living color.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).</li><li>Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).</li><li>Boireau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+cycle+of+HIV-1+in+real-time+and+live+cells.">The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells.</a> J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).</li><li>Janicki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+silencing+to+gene+expression;+real-time+analysis+in+single+cells.">From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells.</a> Cell. 116, 683-698 (2004).</li><li>Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+of+an+mRNA+in+space+and+time.">The life of an mRNA in space and time.</a> J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).</li><li>Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+single+mRNPs+in+nuclei+of+living+cells.">Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells.</a> Science. 304, 1797-1800 (2004).</li><li>Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+at+a+glance.">Fluorescent proteins at a glance.</a> J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).</li><li>Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+tracking+of+individual+fluorescence+particles:+application+to+the+study+of+chromosome+dynamics.">Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics.</a> IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).</li><li>Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-allele+analysis+of+transcription+kinetics+in+living+mammalian+cells.">Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells.</a> Nat Methods. 7, 631-633 (2010).</li><li>Brody, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+kinetics+of+RNA+polymerase+II+elongation+during+co-transcriptional+splicing.">The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing.</a> PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).</li><li>Munoz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+regulates+alternative+splicing+through+inhibition+of+RNA+polymerase+II+elongation.">DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation.</a> Cell. 137, 708-720 (2009).</li><li>Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+of+RNA+polymerase+II+in+living+mammalian+cells.">Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells.</a> Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).</li><li>Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+cycle+of+RNA+polymerase+II+in+living+cells.">The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells.</a> J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).</li></ol>

ويمكن تقسيم طريقة لقياس النشاط بوليميريز الحركية في الخلايا الحية إلى قسمين. الجزء الأول يصف &quot;الرطب&quot; الإجراء الذي يتيح للقياس واسترجاع البيانات من النسخ الحركية مرنا ، بينما في الجزء الثاني ، ويتم تحليل البيانات باستخدام نموذج ODE 5 هناك عدد من الدراسات الت...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th></tr><tr><td> الدوكسيسيكلين </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> FuGENE كاشف ترنسفكأيشن 6 </td><td> روش </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

النشاط الترانسكربتي من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (بول الثاني) هو عملية دينامية وحركية قياس ذلك من عملية الترانسكربتي في الجسم الحي هو من الأهمية. وقد تم قياس حركية بول الثاني باستخدام طرق كيميائية حيوية أو الجزيئي. 1-3 في السنوات الأخيرة ، مع تطور أساليب التصور الجديد ، فقد أصبح من الممكن متابعة النسخ كما يحدث في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية واحد. 4 هنا ونحن تصف كيفية لإجراء تحليل للبول حركية استطالة الثاني على جينات معينة في الخلايا الحية. 5 و 6 عن طريق خط الخلية التي يمكن أن تكون موضع جين معين (DNA) ، ناتجها مرنا ، والمنتج النهائي من البروتين fluorescently المسمى وتصور في الجسم الحي ، فمن الممكن للكشف عن النسخ الفعلية للmRNAs على الجينات في المصالح. fluorescently المفتاحية هي 7 و 8 ومرنا باستخدام نظام MS2 mRNAs للعلامات في الجسم الحي ، حيث 3&#39;UTR من النصوص مرنا يحتوي على 24 حلقة MS2 الجذعية يكرر ، والتي توفر مواقع محددة للغاية ملزمة للبروتين معطف YFP - MS2 أن التسميات مرنا كما هو كتب 9 رصد حركية النسخ نستخدم الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) الأسلوب. بواسطة photobleaching النصوص YFP - MS2 الموسومة الوليدة في موقع النسخ ثم بعد استرداد هذه الإشارة على مر الزمن ، ونحن الحصول على معدل تجميعي للmRNAs أدلى حديثا. 5 وبعبارة أخرى ، YFP - MS2 مضان يعكس الانتعاش الجيل من جديد MS2 الجذعية الحلقات في محاضر الوليدة وملزم من قبل الفلورسنت YFP - MS2 الجزيئات الحرة من دخول nucleoplasm المحيطة بها. ثم يتم تحليل المنحنيات الانتعاش FRAP باستخدام نماذج رياضية رسمية الآلي من خلال سلسلة من المعادلات التفاضلية ، من أجل استرداد المعلمات الوقت الحركية من النسخ.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells at JoVE.com

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

ويتم قياس الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني حركية النسخي على جينات معينة في الخلايا الحية. والموسومة fluorescently mRNAs مستنسخة من الجينات ذات الاهتمام به والانتعاش بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) يتم الحصول على الحركية في الجسم الحي من استطالة النسخي.

قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...