Name: measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00
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YS-T est soutenu par le Conseil européen de la recherche (CER), l&#39;Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israël Cancer Research Fund (ICRF), l&#39;Allemagne et Israël Fondation pour la recherche scientifique et le développement (GIF ), Etats-Unis-Israël binational Science Foundation (BSF), Projet de coopération israélo-allemande (DIP), et les Ministères israéliens de la Science et de la santé, et est Fellow de la famille Stern Jane Lebell en sciences de la vie humaine en université Bar-Ilan. YB est reconnaissante à la Fondation Azrieli pour l&#39;octroi d&#39;une bourse Azrieli.

Le système cellulaire utilisé doit contenir un gène hybride intégré qui comprend des séquences répétées MS2 pour le marquage de l&#39;ARNm dans les cellules vivantes. Dans ce protocole, nous utilisons une lignée cellulaire humaine U2OS abritant un intégré de manière stable β-actine gène, qui est marqué par fluorescence à l&#39;ADN, l&#39;ARN et de protéine 8, comme suit (figure 1A): Le 5 &#39;du gène contient opérateur lac ( LACO) répète - sont utilisés pour étiqueter...

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	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. 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La méthode pour mesurer l&#39;activité polymérase cinétique dans les cellules vivantes peuvent être divisés en deux parties. La première partie décrit le «mouillé» la procédure qui permet la mesure et la récupération des données cinétiques de transcription ARNm, alors que dans la seconde partie, les données sont analysées en utilisant un modèle ODE. 5 Un certain nombre d&#39;études ont maintenant utilisé cette approche pour l&#39;extraction cinétique de la transcription dans les cellules...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Réactifs de transfection FuGENE 6 </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

L&#39;activité transcriptionnelle de l&#39;ARN polymérase II (Pol II) est un processus dynamique et donc de mesurer la cinétique du processus de transcription in vivo est d&#39;importance. Pol II cinétiques ont été mesurées en utilisant des méthodes biochimiques ou moléculaires. 1-3 dernières années, avec le développement de nouvelles méthodes de visualisation, il est devenu possible de suivre la transcription comme il se produit en temps réel dans les cellules vivantes unique. 4 des présentes, nous décrivons comment pour effectuer l&#39;analyse de la cinétique de la Pol II allongement sur ​​un gène spécifique dans les cellules vivantes. 5, 6 utilisant une lignée cellulaire dans laquelle un locus spécifique (ADN), son produit ARNm et la protéine finale peut être marqué par fluorescence et visualisés in vivo , il est possible de détecter la transcription réelle des ARNm du gène d&#39;intérêt. 7, 8 L&#39;ARNm est fluorescence marqués en utilisant le système d&#39;ARNm MS2 marquage in vivo, où le 3&#39;UTR de l&#39;ARNm transcrits contenant 24 MS2 tige-boucle répète, qui fournissent très spécifiques des sites de liaison pour la protéine d&#39;enveloppe YFP-MS2 que les étiquettes de l&#39;ARNm comme il est transcrit. 9 Pour contrôler la cinétique de la transcription, nous utilisons la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) méthode. Par photoblanchiment les transcriptions YFP-MS2-taggés naissante sur le site de la transcription et ensuite après la reprise de ce signal dans le temps, on obtient le taux de synthèse de l&#39;ARNm nouvellement fabriqués. 5 En d&#39;autres termes, YFP-MS2 récupération de fluorescence reflète la nouvelle génération de nouveaux MS2 tiges-boucles dans les transcriptions naissantes et leur liaison par des fluorescents YFP-MS2 gratuitement molécules entrant dans le nucléoplasme environnantes. Les courbes de récupération du PAF sont ensuite analysés en utilisant des modèles mécanistes mathématiques formalisées par une série d&#39;équations différentielles, afin de récupérer les paramètres de temps cinétique de la transcription.

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

L&#39;ARN polymérase II cinétiques transcriptionnelles sont mesurés sur des gènes spécifiques dans les cellules vivantes. ARNm transcrit à partir du gène d&#39;intérêt sont marqués par fluorescence et de l&#39;utilisation de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) la cinétique in vivo de l&#39;élongation de la transcription sont obtenues.

Mesure de la cinétique de la transcription d&#39;ARNm dans les cellules vivantes simples

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

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Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

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In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

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The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

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La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

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L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

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Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...