Name: measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00
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YS-T wird von der European Research Council (ERC), der Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), Deutsch-Israelische Stiftung für Wissenschaftliche Forschung und Entwicklung (GIF unterstützt ), USA-Israel Binationale Science Foundation (BSF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP), und die israelischen Ministerien für Wissenschaft und Gesundheit und ist der Jane Stern Lebell Familie Fellow in Life Sciences an der Bar-Ilan University. YB ist dankbar für die Azrieli Stiftung für die Vergabe eines Stipendiums Azrieli.

Die Zelle verwendet wird, muss über ein integriertes Gen-Konstrukt, das MS2 Wiederholungssequenzen für das Tagging der mRNA in lebenden Zellen enthält. In diesem Protokoll verwenden wir eine menschliche U2OS Zelllinie Beherbergung eines stabil integrierten β-Aktin-Gen, also Fluoreszenz an der DNA, RNA und Protein-Ebene 8 ist markiert, wie folgt (Abbildung 1A): Die 5 &#39;des Gens lac-Operator enthält ( lacO) wiederholt - diese werden verwendet, um das Gen (DNA)-Tag und damit zu...

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	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. 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Die Methode zur Messung Polymerase kinetische Aktivität in lebenden Zellen lassen sich in zwei Teile aufgeteilt werden. Der erste Teil beschreibt die &quot;nassen&quot; Verfahren, das die Mess-und Abrufen der kinetischen Daten der mRNA Transkription ermöglicht, während im zweiten Teil, werden die Daten analysiert mit Hilfe eines ODE-Modell. 5 Eine Reihe von Studien haben nun diesen Ansatz zur Extraktion verwendet Transkription Kinetik in lebenden Zellen 5, 6, 8, 12-14. Der wesentliche Unterschie...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th></tr><tr><td> Doxycyclin </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfektionsreagenz </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

Die transkriptionelle Aktivität der RNA-Polymerase II (Pol II) ist ein dynamischer Prozess und damit die Messung der Kinetik der Transkription in vivo von Bedeutung ist. Pol II Kinetik gemessen wurden mit biochemischen oder molekularbiologischen Methoden. In den letzten Jahren 1-3, mit der Entwicklung neuer Visualisierungs-Methoden ist es möglich geworden, um die Transkription zu folgen, wie es in Echtzeit geschieht in einzelnen lebenden Zellen. 4 hierin beschreiben wir, wie durchführen Analyse der Pol II Dehnung Kinetik auf ein bestimmtes Gen in lebenden Zellen. 5, 6 mit einer Zelllinie, in denen ein bestimmtes Gen-Locus (DNA), die mRNA Produkt, und die endgültige Protein-Produkt fluoreszenzmarkierten und visualisiert werden können in vivo , ist es möglich, die tatsächliche Übertragung der mRNAs auf dem Gen von Interesse zu erkennen. 7, 8 Die mRNA fluoreszierend markiert wird mit dem MS2-System für die Kennzeichnung mRNAs in vivo, in denen die 3&#39;UTR der mRNA-Transkripte enthalten 24 MS2 stem-loop wiederholt, die sehr spezifische Bindungsstellen für den YFP-MS2-Hüllprotein, dass die mRNA-Etiketten, wie sie transkribiert wird stellen. 9 Zur Überwachung der Kinetik der Transkription nutzen wir die Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)-Methode. Durch Bleichen des YFP-MS2-tagged entstehenden Transkripte an der Stelle der Transkription und dann nach der Erholung von diesem Signal im Laufe der Zeit haben wir die Synthese-Rate der neu gemacht mRNAs zu erhalten. 5 In anderen Worten, spiegelt YFP-MS2 Fluoreszenz Erholung der Erzeugung der neuen MS2 Stem-Loops in der aufkeimenden Transkripte und deren Bindung von fluoreszierenden freien YFP-MS2 Moleküle, aus den umliegenden Kernplasma. Die FRAP Erholung Kurven werden dann analysiert mit Hilfe mathematischer mechanistischen Modellen durch eine Reihe von Differentialgleichungen formalisiert, um die kinetische Zeitparameter der Transkription abzurufen.

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Forschung

Biologie

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

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The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

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In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

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Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...