Name: measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells at JoVE.com

י&quot;ש-T נתמכת על ידי המועצה האירופית למחקר (ERC), הקרן הלאומית למדע (ISF) (250/06), ISF, ביכורה, ישראל הקרן לחקר הסרטן (ICRF), גרמנית ישראלי קרן למחקר ופיתוח מדעי (GIF ), ארה&quot;ב וישראל דו לאומית למדע (BSF), גרמניה, פרויקט שיתוף פעולה ישראלי (מח&quot;ש), משרדי הישראלית למדע הבריאות, היא ג&#39;יין שטרן עמית Lebell משפחה במדעי החיים באוניברסיטת בר אילן. י.ב. מודה לקרן עזריאלי לפרס של עמיתי עזריאלי.

מערכת תא המשמש להכיל לבנות גן משולב הכולל MS2 רצפים חוזרים על תיוג ה-mRNA בתאים חיים. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בקו U2OS האנושי תא מחסה בגן ביציבות משולב β-אקטין, זה שכותרתו fluorescently ב-DNA, RNA רמות החלבון 8, כדלקמן (איור 1 א): 5 &#39;של הגן מכיל מפעיל לאק ( לאצו) חוזר - אלה...

<ol>
	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. I., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+in+living+color.">RNA polymerase II transcription in living color.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).</li><li>Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).</li><li>Boireau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+cycle+of+HIV-1+in+real-time+and+live+cells.">The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells.</a> J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).</li><li>Janicki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+silencing+to+gene+expression;+real-time+analysis+in+single+cells.">From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells.</a> Cell. 116, 683-698 (2004).</li><li>Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+of+an+mRNA+in+space+and+time.">The life of an mRNA in space and time.</a> J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).</li><li>Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+single+mRNPs+in+nuclei+of+living+cells.">Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells.</a> Science. 304, 1797-1800 (2004).</li><li>Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+at+a+glance.">Fluorescent proteins at a glance.</a> J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).</li><li>Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+tracking+of+individual+fluorescence+particles:+application+to+the+study+of+chromosome+dynamics.">Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics.</a> IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).</li><li>Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-allele+analysis+of+transcription+kinetics+in+living+mammalian+cells.">Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells.</a> Nat Methods. 7, 631-633 (2010).</li><li>Brody, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+kinetics+of+RNA+polymerase+II+elongation+during+co-transcriptional+splicing.">The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing.</a> PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).</li><li>Munoz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+regulates+alternative+splicing+through+inhibition+of+RNA+polymerase+II+elongation.">DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation.</a> Cell. 137, 708-720 (2009).</li><li>Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+of+RNA+polymerase+II+in+living+mammalian+cells.">Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells.</a> Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).</li><li>Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+cycle+of+RNA+polymerase+II+in+living+cells.">The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells.</a> J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).</li></ol>

השיטה למדידת פעילות פולימראז קינטית בתאים חיים יכול להיות מחולק לשני חלקים. החלק הראשון מתאר את נוהל &quot;רטוב&quot; המאפשר מדידה ואחזור של הנתונים הקינטית של שעתוק ה-mRNA, ואילו בחלק השני, הנתונים נותחו באמצעות מודל אודה. 5 מספר מחקרים מנוצל כיום גישה זו לחילוץ קינטי?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th></tr><tr><td> דוקסיציקלין </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> FuGENE 6 transfection מגיב </td><td> רוש </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

פעילות תעתיק של RNA פולימראז II (Pol II) הוא תהליך דינמי ולכן למדידת קינטיקה של התהליך תעתיק in vivo הוא בעל חשיבות. פול קינטיקה השנייה נמדדו בשיטות ביוכימיות או מולקולריות. 1-3 בשנים האחרונות, עם התפתחות שיטות ההדמיה החדשה, זה הפך להיות אפשרי לעקוב שעתוק כפי שהוא מתרחש בזמן אמת בתאים חיים אחת. 4 בזאת אנו מתארים כיצד לבצע ניתוח של Pol II התארכות קינטיקה על גן ספציפי בתאים חיים. 5, 6 בעזרת קו התא שבו מוקד גן מסוים (DNA), מוצר ה-mRNA שלו, המוצר הסופי חלבון יכול להיות שכותרתו fluorescently ו דמיינו in vivo ניתן לזהות את שעתוק בפועל של mRNAs על הגן של עניין. 7, 8 mRNA מתויג fluorescently באמצעות מערכת MS2 עבור mRNAs תיוג in vivo, שבו 3&#39;UTR של תעתיקי mRNA להכיל 24 MS2 גזע לולאה חוזר, אשר מספקים אתרי קישור ספציפיים מאוד של חלבון YFP-MS2 את המעיל כי התוויות mRNA כפי שהוא עיבד. 9 כדי לפקח על קינטיקה של שעתוק אנו משתמשים השחזור Fluorescence לאחר photobleaching (FRAP) שיטה. על ידי photobleaching YFP-MS2-tagged תמלילי המתהווה באתר של שעתוק ולאחר מכן בעקבות ההתאוששות של האות הזה לאורך זמן, אנו מקבלים את קצב הסינתזה של mRNAs שנעשו לאחרונה. 5 במילים אחרות, YFP-MS2 התאוששות הקרינה משקף את דור החדש של MS2 גזע לולאות בפרוטוקולים המתהווה ומחייבת שלהם על ידי YFP-MS2 פלורסנט חופשי מולקולות להיכנס מ nucleoplasm שמסביב. עקומות ההתאוששות FRAP מנותחים ואז באמצעות מודלים מתמטיים מכניסטית פורמלית על ידי סדרה של משוואות דיפרנציאליות, על מנת לשלוף את הפרמטרים זמן הקינטית של שעתוק.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells at JoVE.com

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNA פולימראז II קינטיקה תעתיק נמדדים על גנים ספציפיים בתאים חיים. mRNAs עיבד מן הגן של עניין מתויגים fluorescently באמצעות שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) ב קינטיקה vivo של התארכות תעתיק מתקבלים.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...