Name: measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00
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YS-T è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca (CER), la Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israele Cancer Research Fund (ICRF), tedesco-israeliano Fondazione per la ricerca scientifica e lo sviluppo (GIF ), Stati Uniti-Israele binazionale Science Foundation (BSF), tedesco-israeliano di cooperazione Project (DIP), ei ministeri israeliani della scienza e della Salute, ed è il Jane Stern Fellow Famiglia LeBell in Scienze della vita alla Bar-Ilan University. YB è grato alla Fondazione Azrieli per l&#39;assegnazione di una borsa Azrieli.

Il sistema cellulare, deve contenere un costrutto integrato gene che comprende MS2 sequenze ripetute per il tagging mRNA nelle cellule viventi. In questo protocollo si usa una linea di cellule umane U2OS asilo ad un stabilmente integrato β-actina gene, che è fluorescente al DNA, RNA e livelli di proteina 8, come segue (Figura 1A): Il 5 &#39;del gene contiene operatore lac ( Laco) ripete - questi sono usato per codificare il gene (DNA) e, quindi, identificare il locus genomico di integrazio...

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	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. I., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+in+living+color.">RNA polymerase II transcription in living color.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).</li><li>Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription.">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).</li><li>Boireau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+cycle+of+HIV-1+in+real-time+and+live+cells.">The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells.</a> J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).</li><li>Janicki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+silencing+to+gene+expression;+real-time+analysis+in+single+cells.">From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells.</a> Cell. 116, 683-698 (2004).</li><li>Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+of+an+mRNA+in+space+and+time.">The life of an mRNA in space and time.</a> J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).</li><li>Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+single+mRNPs+in+nuclei+of+living+cells.">Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells.</a> Science. 304, 1797-1800 (2004).</li><li>Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+at+a+glance.">Fluorescent proteins at a glance.</a> J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).</li><li>Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+tracking+of+individual+fluorescence+particles:+application+to+the+study+of+chromosome+dynamics.">Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics.</a> IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).</li><li>Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-allele+analysis+of+transcription+kinetics+in+living+mammalian+cells.">Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells.</a> Nat Methods. 7, 631-633 (2010).</li><li>Brody, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+kinetics+of+RNA+polymerase+II+elongation+during+co-transcriptional+splicing.">The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing.</a> PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).</li><li>Munoz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+regulates+alternative+splicing+through+inhibition+of+RNA+polymerase+II+elongation.">DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation.</a> Cell. 137, 708-720 (2009).</li><li>Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+of+RNA+polymerase+II+in+living+mammalian+cells.">Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells.</a> Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).</li><li>Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+cycle+of+RNA+polymerase+II+in+living+cells.">The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells.</a> J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).</li></ol>

Il metodo per la misurazione dell&#39;attività cinetica polimerasi nelle cellule viventi possono essere suddivisi in due parti. La prima parte descrive la procedura di &#39;umido&#39;, che consente la misurazione e il recupero dei dati cinetici di trascrizione mRNA, mentre nella seconda parte, i dati vengono analizzati utilizzando un modello ODE. 5 Una serie di studi hanno utilizzato questo metodo per l&#39;estrazione cinetica di trascrizione nelle cellule viventi 5, 6, 8, 12-14. La principale dif...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th></tr><tr><td> Doxiciclina </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE 6 reagenti di trasfezione </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

L&#39;attività trascrizionale della RNA polimerasi II (Pol II) è un processo dinamico e quindi misurare la cinetica del processo di trascrizione in vivo è di importanza. Pol cinetica II sono stati misurati utilizzando metodi biochimici o molecolari. 1-3 Negli ultimi anni, con lo sviluppo di nuovi metodi di visualizzazione, è diventato possibile seguire la trascrizione di quanto avviene in tempo reale in cellule viventi solo 4. Qui si descrivono le modalità di eseguire analisi di Pol II cinetica allungamento su uno specifico gene in cellule viventi. 5, 6 Utilizzando una linea cellulare in cui un locus specifico gene (DNA), il suo prodotto l&#39;mRNA, e il prodotto finale può essere proteina fluorescente e visualizzati in vivo , è possibile rilevare la trascrizione reale di mRNA del gene di interesse. 7, 8 L&#39;mRNA è fluorescente tag MS2 utilizzando il sistema di tagging per mRNA in vivo, dove il 3&#39;UTR dei trascritti di mRNA contiene 24 MS2 stem-loop ripete, che forniscono i siti di legame altamente specifico per il YFP-MS2 proteina di rivestimento che le etichette l&#39;mRNA come è trascritto. 9 Per monitorare la cinetica di trascrizione usiamo il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) metodo. Dal fotodecolorazione il YFP-MS2-tagged trascrizioni nascente nel sito di trascrizione e poi dopo il recupero di questo segnale nel tempo, si ottiene il tasso di sintesi del mRNA di nuova fabbricazione. 5 In altre parole, YFP-MS2 recupero fluorescenza riflette la generazione di nuovo MS2 staminali loop nelle trascrizioni nascente e il loro legame con fluorescente libero YFP-MS2 molecole che entrano dalla nucleoplasma circostante. Le curve di recupero FRAP vengono poi analizzati utilizzando modelli meccanicistici matematici formalizzati da una serie di equazioni differenziali, al fine di recuperare i parametri cinetici tempo di trascrizione.

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l&#39;utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

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In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

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Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

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Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

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Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...