Name: measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00
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YS - Tは、欧州研究評議会（ERC）、イスラエル科学財団（ISF）（250/06）、ISF - Bikura、イスラエル癌研究基金（ICRF）、科学研究と開発のためのドイツとイスラエル基金（GIFでサポートされています）、米国 - イスラエル二国間科学財団（BSF）、ドイツとイスラエルのプロジェクトの協力（DIP）、そして科学と健康のイスラエルの省庁、およびバー- Ilan大学でライフサイエンスのジェーンスターンLebellファミリーフェローです。 YBはAzrieliのフェローシップの受賞のためのAzrieli財団に感謝です。

使用する電池システムは、タグ付け、生細胞におけるmRNAのMS2反復配列を含む統合された遺伝子構築物が含まれている必要があります。 5&#39;遺伝子のがlacオペレーターを含む（：このプロトコルでは、蛍光（図1A）、次のように、DNA、RNAおよび蛋白質レベル8で標識されて安定的に統合されたβ-アクチン遺伝子を、保有する人間のU2OS細胞株を使用lacOは）繰り?...

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	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+regulates+alternative+splicing+through+inhibition+of+RNA+polymerase+II+elongation.">DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation.</a> Cell. 137, 708-720 (2009).</li><li>Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+of+RNA+polymerase+II+in+living+mammalian+cells.">Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells.</a> Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).</li><li>Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+cycle+of+RNA+polymerase+II+in+living+cells.">The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells.</a> J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).</li></ol>

生きた細胞でポリメラーゼ運動活性の測定方法は2つの部分に分けることができます。最初の部分は第二部では、データはODEのモデルを用いて分析されるのに対し、測定し、mRNAの転写の動力学的データの取得を可能にする&quot;ウェット&quot;の手順を説明します。5件の研究の数は今や抽出するためのこのアプローチを利用している生きた細胞を5、6、8、12-14の転写動態。これら?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマ</td></tr><tr><td> FuGENE 6トランスフェクション試薬</td><td>ロッシュ</td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

RNAポリメラーゼII（pol II）の転写活性は、ダイナミックなプロセスであるため、in vivoでの転写過程の動態を測定することは重要である。 pol IIの動力学は、生化学的または分子の方法を用いて測定されている。近年、1-3、新しい可視化手法の開発と、それは一つの生きた細胞でリアルタイムに発生するように転写をフォローすることが可能となっている4ここでは、我々はどのように記述する特定の遺伝子座（DNA）、そのmRNAの製品、および最終のタンパク質産物を蛍光標識し、 生体内で可視化することのできる細胞株を用いた生細胞内の特定の遺伝子ではPol II伸長速度の解析を実行する。5、6 、それは目的の遺伝子のmRNAの実際の転写を検出することが可能である。7、8 mRNAを蛍光mRNA転写産物の3&#39;UTRが24 MS2ステムループを含む生体内でのタギングのmRNAは、のためMS2システムを使ってタグ付けされているそれが転写されるmRNAを標識するYFP - MS2のコートタンパク質に高い特異的結合部位を提供繰り返し、9我々は（FRAP）法を光退色後蛍光回復を使用して転写の動態を監視するには。転写のサイトでYFP - MS2 -タグ付きの新生転写物を退色して、時間をかけてこの信号の回復が続くことによって、我々は新たに作られたmRNAの合成速度を得る5。言い換えると、YFP - MS2蛍光の回復は、世代を反映新しいMS2の蛍光フリーYFP - MS2周辺核質から入る分子による新生の転写産物とそれらの結合の幹ループ。 FRAPの回復曲線は、転写の運動の時間パラメータを取得するために、微分方程式のシリーズが正式な数学的機械論的モデルを用いて分析している。

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...