Name: measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00
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YS-T con el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (CEI), la Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), alemán-israelí Fundación para la Investigación Científica y Desarrollo (GIF ), EE.UU.-Israel Binacional Science Foundation (BSF), Alemania e Israel Cooperación Proyecto (DIP), y los ministerios israelíes de Ciencia y Salud, y es el compañero Jane Stern Familia Lebell en Ciencias de la Vida Humana en la Universidad Bar Ilán. YB agradece a la Fundación Azrieli para la concesión de una beca de Azrieli.

El sistema celular utilizado debe contener una construcción genética integrada que incluye MS2 repetir secuencias para el etiquetado de los ARNm en las células vivas. En este protocolo se utiliza una línea celular humana U2OS albergar un integrado de forma estable β-actina, que es la etiqueta fluorescente en el ADN, el ARN y proteínas 8, de la siguiente manera (Figura 1): El 5 &#39;del gen contiene operador lac ( LACO) repite - estos se utilizan para etiquetar el gen (ADN) y por lo tan...

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	<li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes.">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li><li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transcription+in+real-time.">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li><li>Lamond, A. 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El método para medir la actividad de la polimerasa cinética en las células vivas se pueden dividir en dos partes. La primera parte describe el &quot;húmedo&quot; procedimiento que permite la medición y la recuperación de los datos cinéticos de la transcripción del mRNA, mientras que en la segunda parte, los datos se analizaron mediante un modelo de ODE. 5 Un número de estudios han utilizado este enfoque para la extracción de cinética de transcripción en las células vivas 5, 6, 8, 12-14.</sup...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th></tr><tr><td> Doxiciclina </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE 6 transfección reactivo </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

La actividad transcripcional de la ARN polimerasa II (pol II) es un proceso dinámico y por lo tanto la medición de la cinética del proceso de transcripción en vivo es de suma importancia. Pol cinética II se han medido con métodos bioquímicos o moleculares. 3.1 En los últimos años, con el desarrollo de nuevos métodos de visualización, se ha hecho posible seguir la transcripción, ya que se produce en tiempo real en células vivas individuales. 4 Aquí se describe cómo para llevar a cabo análisis de Pol II cinética de elongación en un gen específico en las células vivas. 5, 6 Uso de una línea celular en el que puede ser un lugar determinado gen (ADN), su producto de ARNm, y el producto final de proteína marcados con fluorescencia y se visualizan en vivo , es posible detectar la transcripción real de ARNm en el gen de interés. 7, 8 El ARNm es marcado con fluorescencia utilizando el sistema MS2 de ARNm marcado en vivo, donde el 3&#39;UTR de las transcripciones de ARNm contiene 24 MS2 tallo-bucle repite, que ofrecen los sitios de unión altamente específica para la proteína de la cubierta YFP-MS2 que las etiquetas de los ARNm que se transcribe. 9 Para controlar la cinética de la transcripción se utiliza la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) método. Por las transcripciones photobleaching YFP-MS2-etiquetados naciente en el sitio de la transcripción y luego, tras la recuperación de esta señal a través del tiempo, se obtiene la tasa de síntesis de los ARNm recién hecho. 5 En otras palabras, YFP-MS2 recuperación de fluorescencia refleja la generación de de nuevo MS2 tallo de bucles en las transcripciones naciente y su unión por fluorescencia YFP-MS2 moléculas libres de entrar en el nucleoplasma circundante. Las curvas de recuperación FRAP se analizan mediante modelos matemáticos mecanicista formalizado por una serie de ecuaciones diferenciales, con el fin de recuperar los parámetros de tiempo de cinética de la transcripción.

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

ARN polimerasa II cinética de transcripción se miden en genes específicos en células vivas. ARNm transcrito a partir del gen de interés están marcados con fluorescencia y el uso de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP), la vivo en la cinética de la elongación de la transcripción se obtienen.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Investigación

Biología

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...