Name: low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ברנדון ג&#39;הרוכסן וקן ב &#39;קפלן עבור מתן גישה זן שמרים השתמשו במחקר זה. המחברים מודים גם חוליו לנין דומינגז-רמירז לסיוע עם צילום וידיאו. JEE מודה תמיכה NIH למימון מענק 5RC1GM91755 מספר.

1. ייצור והרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מפזר החום אלומיניום בתוך 22.96 ס&quot;מ (9 &quot;) במחבת העוגה כ 2 ס&quot;מ מהצד של המחבת, כפי שמוצג באיור 1c שימוש בטוש שחור, חורים סימן עבור מפזר החום אלומיניום הערה:.. אם אלומיניום בלוק (לרכוש חנות גרוטאות מתכת המקומית או באינטרנט <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) לא מגיע עם טרום קדח חורים, תצטרך לארגן יש חורים שנקדחו ו המשוקעים לפני שלב 1 כדי לאבטח את אלומיניום לחסום למחבת את העוגה. השתמשנו 5 חורים כדי לאבטח את גוש לפלטפורמת ו 4 חורים נוספים כדי לאפשר גז בועות חנקן לברוח תחת האלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תיבת cryo-רשת ליד המיקום של מפזר החום אלומיניום לסמן את החריץ ואת כל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים טייס לכל תפקיד מסומן באמצעות קצת # 17 לקדוח חורים החום אלומיניום כיור קצת # 35 לקדוח חורים cryo-רשת התיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חום אלומיניום כיור באמצעות 5 - # 10, 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) ראש שטוח מחוררת ברגים ואומים המקביל כמו גם 15 - # 10 מנקי מניחים שתי דיסקיות מתחת לבלוק אלומיניום השלישי על הישבן של. פשטידת מחבת של כל חור הערה:. המסוכך בחו&quot;ל של גוש אלומיניום בסמוך לאזור הצפייה עלולה לגרום לתנודות המגבילים יכולות הדמיה של הבמה בדוק כדי לוודא שכל הברגים הרכבה הם הידקו בחוזקה.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 3 - # 4, 0.95 ס&quot;מ (3 / 8 &quot;) בסיבוב ברגים מחוררת ואגוזים המקביל מהישבן של פאן פאי לשמש cryo-רשת התיבה הר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת 4 מקלות אכילה יחד בזוגות עם המקל על גבי מחילות. כל זוג Tape לקצוות מרוחקים של המחבת עוגת לשמש מפרידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח רטוב העליון ובחלק התחתון של העוגה עוגת מחבתות בהתאמה עם DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המחבת עוגה עם שתי שכבות של ספריי קצף בידוד. הרטבת כל שכבה לפני שהולכים לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את התבנית לתוך הקצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהפכו את מחבתות הפוך ולחץ על מחבת את העוגה עד מפרידי הקשר את התבנית. מניחים חפץ משוקלל על גבי מחבת את העוגה ולתת לשבת לילה לרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סכין משוננת, לחתוך עודף יבשים ספריי קצף בידוד מקצה מחבתות והסר את מקלות אכילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורידים את הסיר העוגה מהתבנית את העוגה. במחבת עם גוף הקירור העוגה אלומיניום מבודד עכשיו יהיה המכונה &quot;שלב קריוגני&quot; (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לוח פלסטיק שקוף (כל צבע יותר מאשר 3 מ&quot;מ עובי) מעל הבמה קריוגני. סמן בטוש שחור את מיקומו של הר cryo-רשת התיבה על ידי ציור עיגול כ -1.5 פעמים הקוטר של עגול אחד cryo-רשת התיבה. לגזור חור עם 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) ראה חור. הלוח זה יהיה המכונה&quot; מסך הטעינה &quot;(איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ללוח שקוף חדש מעל הבמה קריוגני ומניחים על מיקרוסקופ עם מפזר החום ישירות תחת עדשות אובייקטיבי. בטוש שחור, סימן את הנתיב של היעדים כפי שהם לסובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לאורך הקו המסומן הסרת חצי מעגל מקצה הלוח. ניתן להשיג זאת עם פאזל או בעזרת 7.62 ס&quot;מ (3 &quot;) חור ראיתי מספר פעמים כפי שמוצג בסרטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לחתוך חור 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) במרחק חצי העיגול, אבל עדיין בתוך השטח של המנה. זה יהיה נמל למילוי חנקן נוזלי (באעכליה 2) אם תוך ירידה ברמות הדמיה. הלוח הזה יופנה בשם &quot;מסך הצפייה&quot; (איור 1 ג&#39;). </li></ol> 2. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל שלב יומן שמרים תאים שגודלו סינתטי (SC) התקשורת מלאה הריכוז המתאים של 1x10 6 תאים / מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;ל של השמרים בדילול הם pipetted על R2 / 1 400 רשת המחוררת פחמן מצופה נחושת cryo-EM רשת (ספקי SPI, במערב צ&#39;סטר, פנסילבניה) וכן מותר לספוג למשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם משם נוזל עודף מפני השטח לרשת על ידי נגיעה בחלק האחורי של הרשת לפיסת קרוע של רקמה רכה תאית (Kimwipe) למשך 2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, הרשת ניתן לכבס עם 3 טיפות μL של מים (1-3 פעמים), ואת הרשעים משם כמו בשלב 3 של סופג מאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לפני הגמר, המדגם הוא נטען לתוך המקפיא לצלול פנאומטי והרשת תלוי נשטף כמו בשלב 2.4. לאחר סופג את הרשת עם נייר קרוע (Kimwipe) כדי להסיר את רוב המים מפני השטח, הרשת הוא צלל לתוך באעכליה 2 מקורר אתאן נוזלי והועברו תיבת cryo-רשת אחסון עבור הערה: 1. חשוב להשאיר שכבה של נוזל דק ככל האפשר על פני השטח כדי למנוע התייבשות המדגם. לא נכון יהיה גם סופג לייבש את המדגם או לעזוב קרח אטומה האלקטרון הקורה. </li></ol> 3. Cryo-Light מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הבמה עם קריוגניבאעכליה 2 במהירות לכסות עם מסך הטעינה (לוח פלסטיק עם 1.9 ס&quot;מ בודד (3 / 4 &quot;) חור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתכת מגיע באעכליה 2 טמפרטורה, להעביר את תיבת cryo-רשת דרך 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) חור של המסך טעינה לתוך להעביר את הר שנוצר על ידי 3 ברגים המתואר A5 חלק. הברג החוצה את תיבת cryo-רשת מבעל שלה להסיר את בעל גישה משופרת. שמור בעל cryo-רשת בתיבה תחת באעכליה 2 בתוך דיואר נפרדת עד שלב 3.10. תיבת cryo-רשת צריך גם להיות כל הזמן תחת באעכליה 2 רשת כדי למנוע התחממות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . דיו באעכליה 2 בשלב קריוגני ממש מתחת העליון של מפזר החום אלומיניום הערה: באעכליה 2 רמות יש לבדוק מעת לעת ומילא בתהליך הדמיה כדי להבטיח באעכליה 2 הוא ברציפות במגע עם גוף הקירור. באופן כללי, מילוי מתרחשת כל 10 דקות דרך נמל למלא את המסך לצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מגניב קצה פינצטה ב באעכליה 2, ולאחר מכן להעביר לרשת שלך (ים) על גבי משטח שטוח הצפייה של הכיור אלומיניום חום עם פינצטה, באמצעות 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) חור של מסך הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזיז את cryo-הבמה מתחת פתחים המטרה של מיקרוסקופ אור משתקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את מסך הצפייה שקוף על גבי מסך הטעינה. ואז לאט לאט להסיר את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מתחת הערה צפייה במסך:. בשלב זה, המדגם הוא הפגיע ביותר. כל זרמי אוויר סביב המיקרוסקופ צריך להיות ממוזער, ביניהם: נשימה, פתח את הדלת הסמוכה, אנשים חולפים, וכו &#39;אנו ממליצים לובש facemask או תלוי מגן פנים שקוף מתחת למיקרוסקופ מהעיניות כאמצעי זהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העדשות אובייקטיבית לתוך הסביבה גז קר חנקן של הבמה cryo ולסרוק למדגם על שטח חום שטוחה כיור הצפייה. באמצעות אור רגיל בהיר בשדה מיקרוסקופיה להתמקד טכניקות על רשת עם מטרה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את מרכז ולקחת תמונה כללית. מפרט לגבי עדשות מיקרוסקופ אור משמש לצורך הניסוי הזה המפורטים בסעיף חומרים ניסויית. הערה: באעכליה 2 לא בא במגע עם עדשות אובייקטיבי יש לנו עדיין לראות את ההשפלה של תמונות או נזק עדשות מהשפעות קירור . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בהגדלה גבוהה על שטח של עניין לרכוש נתונים עם שדה בהיר, שדה חשוך, אור מקוטב או דימות פלואורסצנטי. הקפד לרשום את המיקום של אזור הריבית על התמונה שדה נמוך בהיר הגדלה עבור מתאם בעתיד. אם כל אמצעי הזהירות המפורטים לעיל עבור מילוי באעכליה 2 הם אחריו, ולאחר מכן לחץ חיובי החנקן מתאדים מספיקה כדי לשמור על הסביבה זיהום חופשי (עצמאי של החדר לחות) למשך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם סיים, להחליף את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מעל מסך התצוגה. הסר את המסך לצפייה על ידי האטת מחליק אותו מתחת למסך הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבמה cryo מן מיקרוסקופ עם פינצטה מקורר מראש, להעביר את הרשת בחזרה אל תיבת cryo-לרשת. בורג בעל cryo-רשת התיבה לתוך תיבת cryo-רשת לאטום נגד הסביבה ולהעביר את המחזיק ל דיואר LN2 לאחסון הדמיה בעתיד. </li></ol> 4. מיקרוסקופית אלקטרונים cryo- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טכניקות סטנדרטיות והקים, לטעון את רשת מדגם לתוך המחזק cryo-EM העברה תוך שמירה על הדגימה בטמפרטורת חנקן נוזלי בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את cryo-מחזיק עם רשת מדגם לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאור הגדלה מתאים נמוכה (50-500x הגדלה נומינלית), למצוא את המרכז של הרשת המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שנאספו בעבר נמוך cryo-LM הגדלה נתונים צעד 3.7 כדי לקבוע את הכיוון היחסי של כרטיסיות המרכזי של רשת נחושת (כמתואר באיור 2), לזהות אזורים המדויק של עניין המתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך יישור מיקרוסקופ, במינון נמוך cryo-EM הדמיה איסוף הנתונים. </li></ol> 5. נציג תוצאות השלב קריוגני (איור 1 א) היא דרך יעילה לאיסוף cryo-LM נתונים עבור מיקרוסקופיה cryo-פלואורסצנציה וניתוח cryo-LM/cryo-EM גומל. איור 2 מראה כיצד שילוב של תמונות נמוך וגבוה cryo-LM ההגדלה מאפשר לך לבנות מפות התייחסות לכוון אותך לאזורים ספציפיים cryo-EM. כתוצאה cryo-LM התייחסות המפה (איור 2b) נוצל במהלך רכישת נתונים cryo-EM לאתר אזורים המדויק שמוצג באיור 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. שלב קריוגני. א) הפריסה של השלב קריוגני מורכב העברת cryo-רשת תיבה הר הצביעו wהחץ ith לבן מפזר החום אלומיניום. רשתות מועברים תחת באעכליה 2 מתוך תיבת cryo-לרשת והניח ישירות על אזור התצוגה הכיור של חום, כמצוין על ידי החץ השחור. ב) תמונה המתארת ​​את השלב קריוגני עם טעינת מסך. חור במסך הטעינה ממוקם ישירות מעל cryo-רשת התיבה הר משמש ליציאת להעביר דגימות להעברת דגימות תיבת cryo-הרשת לאזור מדגם צפייה על מפזר החום עם פינצטה. ג) קריוגני בשלב בעמדה תחת עדשות אובייקטיבי עם מסך צפייה במקום. נתק מיוחד על המסך מאפשר צפייה עדשות אובייקטיבי הנדנדה בקלות למצב מבלי להזיז את הבמה קריוגני. חור במסך הצפייה הרחק מאזור מדגם משמש באעכליה 2 למלא נמל לחדש באעכליה 2 רמות במידת הצורך. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניווט LM-cryo ללימודי גומל.) בהגדלה נמוכה cryo-LM נוף של תאים שמרים דבק רשת מדגם. ב) אותה תמונה ב (א) ועליהן תמונה בהגדלה גבוהה הקרינה בשטח של עניין עם מצולע כתום מלא לציון מרכז של רשת המדגם. המרכז מורכב מקבוצה של ארבעה ריבועים, שלושה שיש לשונית מתכת נוספת הפתוח הלאה. במשך שלושה ריבועים עם לשונית מתכת נוספת, שני זוגות חולקים על הכרטיסייה על צירים ארוכים וקצרים להרכיב מרכז אסימטרי. מרכז זה אסימטרית ניתן לראות בפינה השמאלית העליונה שימשה כדי לציין את זווית סיבוב handedness של הרשת בין cryo-LM ו cryo-EM. מאחד נמוך התמונה הגדלה באזורים רבים של עניין ניתן לסמן ושימש המפה התייחסות לאתר אזורים זהים cryo-EM. ג) מוגדל הקרינה cryo-LM תמונה של האזור של עניין (ב). HTA1-CFP, סמן בטרמינל C-CFP היסטון, ניתן לראות מבנה punctate ירוק תיוג את מיקומו של הגרעין. ד) תמונה cryo-EM של האזור המקביל ב (ג). ברים סולם מייצגים 50 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מתאם של cryo-LM ו cryo-EM. שני שדות הראייה המתארת ​​שמרים תאים זהים בקורלציה עם שדה cryo-בהיר (א, ד), cryo-פלואורסצנטי (ב, ה), ו cryo-EM (ג, ו ). ברים סולם מייצגים 5 מיקרון.

<ol>
	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

<p class="jove_content"&gt; שימוש הבמה קריוגני שלנו הכנת המדגם טכניקות, מחקרים המתאם בין cryo-LM ו cryo-EM התערוכה מספר יתרונות על פני הגישות המסורתיות בטמפרטורת החדר, כולל אך לא מוגבל ל: קיבוע מהיר<sup&gt; 1,2</sup&gt;, הקטינה photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt;, וסריקה של שלמות המדגם לפני cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; או כימי קיבעון / הטבעה<sup&gt; 6</sup&gt;. אחד צווארי בקבוק עבור cryo-EM איסוף נתונים הוא הזמן הנדרש הן העברת מדגם לתוך TEM ו לסרוק את הרשת כדי למצוא אזורים מתאימים לתמונה. עם רכישת נתונים מהירה של cryo-LM<sup&gt; 5</sup&gt;, הזמן המוקדש למציאת תאים טוב יכול להיות מופחת במידה ניכרת. לפיכך, אנו יכולים לחסוך זמן וכסף ולצמצם את צוואר הבקבוק על ידי מראש סריקת מיפוי תחומי עניין cryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; שלבי קריוגני יקר יותר או מורכבים עשוי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה cryo-LM. עם זאת, בשלב מפוברק כאן היא יותר ממספקת עבור יישומים רבים. אם cryo-LM הדמיה רשת העברות מדגם מבוצעות בזהירות כפי שמתואר בטקסט ווידאו, הדמיה מלאה זיהום חופשי יכול להיות מושלם. שיטה זו מאפשרת קשר ישיר של נתונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלקטרון באותו תא, אברון או מורכב macromolecular מפוזרים על התמיכה פחמן או בתוך קטע רקמה דקה<sup&gt; 7</sup&gt;. יש לציין כי ערך בשלב זה קריוגני חורג מחקרים המצטרף cryo-LM/cryo-EM לתחום במיקרוסקופ אור כולה. שלב זה קריוגני הוא גם מתאים הן דוגמאות וצבעים עדינים fluorophore / כתמים<sup&gt; 8</sup&gt;, נקודות קוונטיות, או החלבונים המתויגים fluorescently<sup&gt; 9</sup&gt; זה עשוי להיות לא יציב במהלך קיבוע כימי בטמפרטורה בחדר והטבעה עם glutaraldehyde ו paraformaldehyde. כתוצאה מכך, אנו מקווים כי זה שלב קריוגני תספק גישה גדולה יותר למעוניינים cryo-LM, שהיו בעבר נרתע גישה העלות מספקת.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; פתרון בעיות cryo-Light מיקרוסקופית</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. לדוגמה ספיחה:</em&gt; מדגמים שונים יכולים להפגין משתנה מאפיינים ספיחה לתמוך פחמן. אתה עלול למצוא לנכון להשתמש בסוגים אחרים של רשתות תמיכה כגון פחמן רציפה, פחמן המחוררת, או רשתות מצופה formvar לתמיכה המדגם. בנוסף, אם המדגם הוא מחייב את הסורגים נחושת של הרשת ולא משטח הפחמן, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כימיה של פני השטח הפחמן על ידי דוגרים את הרשת עם סוכן הרטבה או על ידי זוהר ופריקה לפני כן המדגם.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. שלב יציבות:</em&gt; אם אתה מבחין הרטט, סביר להניח עקב הבמה מדגם להיות עמוסה עם משקל ולא המבעבע של LN2. המשקל הנוסף של שלב קריוגני, יכול לפעמים לגרום לתנודות בתדירות נמוכה לשדר לאורך הבמה מיקרוסקופ רגיל 3-ציר הנסיעה, להשפיע לרעה על דימות באמצעות טשטוש. זה יכול בקלות להיות מתוקן על ידי תמיכה לשלב נסיעה של מיקרוסקופ מלמטה עם או להרים מיני מתכווננת או מתאם מתכווננת עם בורג כפול נשק, כפי שמוצג בסרטון. שני אלה במנגנוני תמיכה מתכווננת אינטראקציה עם החלק הלא ניד של הבמה לנסוע ולכן עדיין היתרי X ו-Y ציר תרגום כנדרש הדמיה.</p

טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th><th> עלות </th></tr><tr><td> 1-22.86 ס&quot;מ (9 &quot;) פשטידת מחבת עם קצה משופע </td><td> טוב קוק </td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 4.39 $ </td></tr><tr><td> 1-22.86 ס&quot;מ (9 &quot;) עוגת מחבת </td><td> טוב קוק </td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 4.93 $ </td></tr><tr><td> 4 זוגות של מקלות אכילה </td><td></td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 0.50 $ </td></tr><tr><td> 1 - ספריי קצף הגדול Stuff </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 5.98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm לחסום x1cm של אלומיניום </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי או חצר גרוטאות מתכת </td><td> 10.00 $ </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) ראש שטוח מחוררת ברגים w / אגוזים </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 3 - 4 0.95 ס&quot;מ (3 / 8 &quot;) עגול מחוררת ברגים w / אגוזים </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 מנקי </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 2 - פלסטיק שקוף כתיבה </td><td></td><td></td><td> משרד מקומי חנות </td><td> 6.84 $ </td></tr><tr><td> 1 - cryo-EM רשת בעל תיבת </td><td> טד פלה </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - cryo-EM תיבת לרשת מוט טיפול </td><td> טד פלה </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 הסרט המחוררת פחמן, 400-רשת cryo-EM נחושת רשת תמיכה </td><td> SPI ספקי </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> ניסיוני חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן שמרים: Hta1-CFP: קן (נכ&quot;ק-3382: מאטה, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP: KanMX6 ממעבדת קפלן ב UC Davis). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryo-Light מיקרוסקופית: cryo-מיקרוסקופ אור תמונות צולמו על מיקרוסקופ הלייקה DM4000M המשקף עם DFC310 לייקה FX מצלמת CCD. שדה מוארת, שדה כהה ותמונות Fluorescence נרכשו או באמצעות PL HCX FLUOTAR 5x 0.15 NA אובייקטיבי אוויר, PL HCX FLUOTAR אובייקטיבי 10x 0.30 NA אוויר, FLUOTAR PL 50x 0.55 אובייקטיבי NA אוויר או 100x NPLAN 0.75 אובייקטיבי NA האוויר. שדה מוארת ותמונות שדה כהה משמש מנורה 12V 100W טונגסטן כמקור אור. עבור פלואורסצנטי, EL6000 מנורת UV שימש מקור בשיתוף עם JC1 לייקה (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 &amp; LP 580) Cube סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryo-Transmission מיקרוסקופית אלקטרונים: cryo-EM התמונות נרכשו על מיקרוסקופ Jem-2100-FEG אלקטרונים הילוכים (JEOL, יפן) הפעלה ב 200 קו ניצול 626 Gatan cryo-להעביר לבעל (Gatan, ארה&quot;ב). Micrographs נרשמו בהגדלה הנומינלי של X 50, 200, 1200 ו - 4000 על 4096 x 4096 פיקסלים טיץ מצלמת CCD (TVIPS, גאוטינג, גרמניה). </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

צימוד של מיקרוסקופיה cryo-אור (cryo-LM) ו במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-(cryo-EM) מהווה מספר יתרונות להבנת הדינמיקה הסלולר ultrastructure. ראשית, תאים ניתן הדמיה בסביבה יליד ליד טכניקות שניהם. שנית, בשל תהליך vitrification, דגימות נשמרים על ידי immobilization פיזי מהיר יותר מאשר קיבוע כימי איטי. שלישית, הדמיה מדגם זהה עם שני cryo-LM ו cryo-EM מספק המתאם של נתונים מתא בודד, ולא השוואה של &quot;מדגמים מייצגים&quot;. למרות היתרונות הללו ידועים ממחקרים קודמים, השימוש הנרחב המצטרף cryo-LM ו cryo-EM נשאר מוגבל בשל חשבון והמורכבות של רכישת או בניית מיקרוסקופ מתאים קריוגני שלב אור. כאן אנו מדגימים את הרכבה, ושימוש בשלב קריוגני יקר זה יכול להיות מפוברק במעבדה כל פחות מ 40 $ עם חלקים למצוא בכתובת חומרה מקומיים וחנויות מכולת. שלב זה cryo-LM מיועד לשימוש עם מיקרוסקופים האור המוחזר כי מצוידים זמן האוויר מטרות עבודה מרחוק. עבור המצטרף cryo-LM ו cryo-EM מחקרים, אנו להתאים את השימוש של פחמן סטנדרטי מצופה 3 מ&quot;מ cryo-EM רשתות כמו תומך הדגימה. לאחר adsorbing המדגם לרשת, פרוטוקולים הוקמה בעבר עבור vitrifying המדגם והעברת / טיפול לרשת הן בעקבות להתיר טכניקה רב הדמיה. כתוצאה מכך, התקנה זו מאפשרת לכל מעבדה עם מיקרוסקופ האור המוחזר כדי לקבל גישה המצטרף הדמיה ישירה של דגימות hydrated קפואים.

Watch this Scientific Journal Video about Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy at JoVE.com

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

אנו מדגימים את ייצור של השלב בעלות נמוכה קריוגני שתוכנן מיקרוסקופים האור המוחזר ביותר. שלב זה במעבדה בנוי קריוגני מאפשרת הדמיה המצטרף יעיל ואמין בין cryo-אור cryo-אלקטרונים מיקרוסקופית.

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

דיגום מהיר ועלות נמוכה של מכשירים רפואיים באמצעות 3D מודפס תבניות להזרקת נוזלים

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

עיצוב של מקור פתוח, ביודיו בעלות נמוכה ומזון נמס ההבלטה מדפסת תלת-ממד

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...