Name: low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy at JoVE.com

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan bu maya nesilin erişim sağlamak için Brandon J. Zipp ve Ken B. Kaplan teşekkür etmek istiyoruz. Yazarlar ayrıca Julio Lenin Dominguez-Ramirez videoya ile yardım için teşekkür ederim. JEE NIH fon desteği hibe sayısı 5RC1GM91755 kabul eder.

1. Imalat ve montaj <ol><li> Şekil 1c gösterildiği gibi. 22,96 cm (9 &quot;) pasta pan pan tarafında yaklaşık 2 cm, siyah bir marker kalem, alüminyum heatsink işareti delikleri Not kullanma içinde alüminyum heatsink Yeri: Eğer alüminyum blok (yerel bir hurda metal dükkanı veya çevrimiçi satın <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) ön delikli gelmez, delik delinmiş ve alüminyum güvence altına almak için 1 adım önce gömme düzenlemek için ihtiyacınız olacak pasta tava blok nitrojen gaz kabarcıkları alüminyum altından kaçmasına izin için, platform ve 4 ekstra delikler blok güvence altına almak için 5 delik. </li><li> Alüminyum ısı lavabonun bulunduğu yere yakın cryo-grid kutusu yerleştirin ve çentik ve her iki tarafın işareti. </li><li> Alüminyum heatsink delikler için, # 17 matkap ucu ve # 35 cryo-Grid kutusu delikler için bir matkap ucu kullanarak her işaretli pozisyon için pilot delikler delin. </li><li> Mount 5 kullanılarak alüminyum heatsink - # 10, 1.9 cm (3 / 4 &quot;) düz kafa oluklu cıvata ve uygun somun gibi 15 - # 10 pullar iki alüminyum blok altında pullar ve arka üçüncü. Her delik Not pasta tava izleme alanı yakınında alüminyum blok Teminatsız çıkıntılar sahne görüntüleme yetenekleri sınırı titreşimler neden olabilir: Tüm montaj cıvataları iyice sıkılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> Takın 3 - # 4, 0.95 cm (3 / 8 &quot;) arka cryo-ızgara kutusu montajı olarak hareket pasta tava, oluklu cıvata ve ilgili fındık yuvarlak. </li><li> 4 çubuklarını başka bir tepesinde bir Çubuk ile çiftleri birlikte Teyp. Kek tavada ters kenarlarına Şerit ayırıcılar olarak hareket etmek her çift. </li><li> Islak kek ve pasta alt ve üst yüzey GKD 2 O. ile sırasıyla tava </li><li> Sprey köpük yalıtım iki kat kek tava ile doldurun. Sonraki adıma geçmeden önce her bir katmanı Islatma. </li><li> Köpüğe pasta tava basın. </li><li> Tava baş aşağı çevirin ve ayırıcılar pasta tava başvurun kadar kek tava basın. Kek tava tepesinde herhangi bir ağırlıklı nesne yerleştirin ve tedavi etmek için bir gece bekletin. </li><li> Tırtıklı bıçak ile, aşırı kuru tava kenarından sprey köpük yalıtım kesip çubuklarını kaldırmak. </li><li> Kek pasta pan pan çıkarın. Alüminyum ısı lavabo pasta tava şimdi yalıtılmış ve &quot;kriyojenik sahne&quot; (Şekil 1a) olarak sevk edilecektir. </li><li> Kriyojenik sahne üstünden şeffaf plastik bir panoya (herhangi bir renk ve daha fazla 3 mm kalınlığında) yerleştirin. Siyah bir işaret, tek bir turda cryo-grid çapı yaklaşık 1.5 kat bir daire çizerek cryo-ızgara kutusu montaj konumu ile işaretleyin. 1.9 cm (3 / 4 &quot;) kesip delik delik gördüm. Bu panoya olarak sevk edilecektir&quot; yükleme ekranı &quot;(Şekil 1b). </li><li> Kriyojenik sahne ve objektif lensleri altında doğrudan ısı lavabo mikroskop yer tepesine yeni bir şeffaf panoya koyun. Döndürme gibi siyah bir belirteç ile hedeflerin yolunu işaretleyin. </li><li> Pano kenarından bir yarım daire çıkarmadan işaretlenen hat boyunca kesin. Bu bir yapboz veya video gösterildiği gibi delik birden çok kez gördüm 7,62 cm (3 &quot;) kullanılarak yapılabilir. </li><li> Sonunda çanağı alanı içinde yarım daire uzakta ama yine de 1.9 cm (3 / 4 &quot;) delik kesti. Seviyeleri düşer görüntüleme Bu panoya sevk edilecektir ise sıvı azot dolumu (LN 2) Bu bağlantı noktası olacak &quot;izleme ekranı&quot; (Şekil 1c). </li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> 1x10 6 hücre / mL su uygun bir konsantrasyon sentetik tam (SC) medya yetişen günlük faz maya hücreleri sulandırınız. </li><li> Seyreltilmiş maya 2 mL R2 / 1 400 örgü holey karbon kaplı bakır cryo-EM ızgara (SPI Malzemeleri, West Chester, PA) üzerine pipetlenebilir ve emilmesi için 15 saniye izin verilir. </li><li> 2 saniye için yumuşak selüloz doku yırtılmış parça (Kimwipe) ızgara arkasına dokunarak ızgara yüzeyinden uzakta aşırı sıvı Blot. </li><li> Gerekirse, ızgara, 3 su damlaları mcL (1-3 kez), ve kötü uzakta 3. adımda arka blot ile yıkanmalıdır. </li><li> Son yıkama önce, örnek pnömatik dalma dondurucu içine yüklenen ve asılı ızgara adım 2.4 gibi yıkanır. Su yüzeyinden çoğunluğu kaldırmak için yırtık kağıt mendil (Kimwipe) ızgara blot sonra, ızgara sıvı etan soğutmalı LN 2 içine daldı ve bir depolama Not 1 cryo-grid kutusuna aktarılır: önemlidir. numune nemli tutmak için, mümkün olduğunca ince sıvı bir tabaka yüzeyde bırakın. Yanlış blot ya örnek kurumasına veya elektron ışını opak buz terk edecektir. </li></ol> 3. Cryo-Işık Mikroskopi <ol><li> Kriyojenik aşaması ile doldurunLN 2 ve hızlı yükleme ekranı ile (1.9 cm (3 / 4 &quot;) tek delik ile plastik panoya) kapsar . </li><li> Metal parçası A5 açıklanan 3 vida ile monte 1.9 cm (3 / 4 &quot;) yükleme ekranında ve transfer delik içine cryo-grid transfer, LN 2 sıcaklık ulaşır. Sökün cryo-grid onun sahibinin ve iyileştirilmiş erişim için tutucu kaldırmak adım 3.10 kadar ayrı bir Dewar cryo grid sahibi LN 2 altında tutun. cryo-grid kutusu da örnek ızgara ısınmayı önlemek için LN 2 altında tutulmalıdır. </li><li> Yedek sadece alüminyum ısı lavabo üst altında kriyojenik aşamasında LN 2 Not: LN 2 düzeyleri periyodik olarak kontrol ve LN 2 ısı lavabo ile sürekli temas sağlamak için görüntüleme işlemi sırasında yenilenmeleri gerekir. Genel olarak, dolum görüntüleme ekranı dolgu bağlantı noktası üzerinden her 10 dakikada oluşur. </li><li> LN 2 Pre-serin cımbız ucu, daha sonra 1.9 cm (3 / 4 &quot;) yükleme ekranı delik kullanarak, cımbız ile alüminyum ısı lavabo düz görüntüleme yüzeye ızgara (ler) aktarmak. </li><li> Yansıyan ışık mikroskobu objektif diyafram altında dikkatlice cryo aşamalı taşımak. </li><li> Yükleme ekranı tepesinde şeffaf izleme ekranı yerleştirin. Sonra yavaş yavaş, görüntüleme ekranı Not altına kaydırarak yükleme ekranı kaldırmak: Bu noktada, örnek, en savunmasız. Mikroskop etrafında bulunan tüm hava akımları da dahil olmak üzere minimize edilmelidir: Yakın bir yerde kapı açma, insanlar geçmiş yürüyüş, solunum, vb Biz bir yüz maskesi giymiş veya bir tedbir olarak mikroskop göz mercekleri altında şeffaf bir yüz maskesi asılı öneririz. </li><li> Cryo kademeli ve düz bir ısı emici izleme alanı örnek için tarama soğuk azot gazı ortama objektif lensleri döndürün. Izgara üzerinde standart parlak bir alan ışık mikroskopi teknikleri odak merkezini bulmak ve genel bir görüntü almak için düşük bir büyütme amacı ile kullanarak. Bu deney için kullanılan ışık mikroskobu lensler ile ilgili Özellikler Deneysel Malzeme bölümünde listelenen Not: LN 2 nesnel lensler ile temas gelmez ve biz, soğutma etkilerinden görüntü veya lenslerin zarar bozulması henüz görmedik. . </li><li> Bir ilgi alanında yüksek büyütmeli Odak ve aydınlık alan, karanlık alan, polarize ışık veya floresan görüntüleme veri almak. Gelecek korelasyon düşük büyütme parlak bir alan görüntü, ilgi alanın konumunu kaydetmek için emin olun. LN 2 dolumu için yukarıda listelenen tüm önlemleri takip edilirse, daha sonra buharlaşan azot pozitif basınç görüntüleme süresi için bir kontaminasyon ortamda (oda nem bağımsız) korumak için yeterli. </li><li> Bittiği zaman, yükleme ekranında görüntüleme ekranın üst üzerinde kaydırarak değiştirin. Yükleme ekranının altında kaydırarak yavaşlatarak görüntüleme ekranı çıkarın. </li><li> Mikroskop cryo sahne çıkarın ve önceden soğutulmuş cımbız, cryo-grid kutusuna geri ızgara transfer. Çevreye karşı mühür ve LN2 Dewar sahibinin, depolama ve gelecekteki görüntüleme için transfer etmek cryo-ızgara kutusu içine cryo grid sahibi vidalayın. </li></ol> 4. Cryo-Elektron Mikroskobu <ol><li> Her zaman sıvı azot sıcaklığında numune tutarken, standart ve yerleşmiş teknikleri, bir cryo-EM transfer sahibinin örnek ızgara içine yerleştirin. </li><li> Transmisyon Elektron Mikroskobu örnek ızgara ile kriyo sahibi yerleştirin. </li><li> Uygun bir düşük büyütme (50 500x, nominal büyütme), örnek ızgara merkezinde bulabilirsiniz. </li><li> Izgara merkezi bakır sekmeleri göreli bir yönünü (Şekil 2&#39;de açıklandığı gibi) belirlemek ve korelasyon için kesin ilgi alanları belirlemek için adım 3,7 &#39;den daha önce toplanan düşük büyütme cryo-LM veri kullanın. </li><li> Mikroskop hizalama, düşük doz cryo-EM görüntüleme ve veri toplama ile devam edin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Kriyojenik aşamada (Şekil 1a) cryo-LM cryo floresan mikroskopi ve bağlaşık cryo-LM/cryo-EM analiz için veri toplamak için etkili bir yoldur. Şekil 2, düşük ve yüksek büyütme cryo-LM görüntüleri kombinasyonu cryo-EM belirli alanlarda doğrudan referans haritalar oluşturmanıza olanak verir nasıl gösterir. Cryo-LM referans haritası (Şekil 2b), Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi tam bölgeleri bulmak için cryo-EM veri toplama sırasında kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Kriyojenik Sahne) kriyojenik sahne düzeni monte w belirtilen bir cryo-grid transferi oluşuri. beyaz bir ok ve bir alüminyum heatsink. Izgaralar, cryo-grid kutusundan LN 2 kapsamında aktarılır ve siyah ok ile gösterildiği gibi doğrudan ısı emici görüntüleme alanına yerleştirilir. B) Görüntü yükleme ekranı ile kriyojenik sahne betimleyen . Bir liman örnekleri aktarmak ve cımbız ile ısı emici örnek izleme alanı cryo-grid örnekleri hareket c) kriyojenik olarak yükleme ekranı delik cryo-Grid kutusu montaj ve eylemleri üzerinden doğrudan yerleştirilir yerinde izleme ekranı ile objektif lensler altında pozisyon sahne. Görüntüleme ekranında özel kesme nesnel lensler kriyojenik aşamada hareket ettirmeden kolayca yerleştirin salıncak sağlar. Örnek alanın uzak görüntüleme ekranındaki delik LN 2 doldurmak gerekirse LN 2 seviyeleri doldurmak için bağlantı noktası olarak görür. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 cryo-LM bağıntılı çalışmalar için gezinme. Maya hücreleri a) Düşük büyütme cryo-LM bir örnek ızgara yapıştırılır. B) &#39;de aynı görüntü (a) bir ilgi alanı yüksek bir büyütme floresan görüntü ile kaplanmış ve dolu bir portakal çokgen ile örnek ızgara merkezi işareti. Merkezi dört ekstra bir metal sekmesini ve dördüncü açık olan meydanlar, üç bir grup oluşur. Ekstra bir metal sekmesinde üç kare, asimetrik bir merkez oluşturan kısa ve uzun eksenleri hakkında iki çift sekme paylaşın. Bu asimetrik merkez sol üst köşesinde görülebilir ve cryo-LM ve cryo-EM arasında ızgara dönme açısı ve ellilik belirtmek için kullanılır oldu. Faiz, düşük bir büyütme görüntü birçok alanda itibaren işaretlenir ve cryo-EM aynı alanları bulmak için bir referans haritası olarak kullanılır. C), (b) ilgi alanı büyütülmüş floresan cryo-LM görüntü . HTA1-CFP, c-terminal CFP histon işaretleyici, çekirdeğin konum etiketleme yeşil noktalı bir yapı olarak görülebilir. D) karşılık gelen alan cryo-EM görüntü (c) Ölçek bar, 50 mikron temsil eder . <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 cryo-LM ve cryo-EM Korelasyon aynı maya hücreleri betimleyen iki alan görüş (c, f cryo parlak alan (d), cryo-floresans (b, e) ve cryo-EM ile korele 5 mikron). Ölçek bar temsil eder.

<ol>
	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.

<p class="jove_content"&gt; Bizim kriyojenik sahne ve numune hazırlama teknikleri, cryo-LM ve cryo-EM arasında bağıntılı çalışmalar da dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı olmayan yaklaşımlar geleneksel oda sıcaklığı üzerinde birçok faydaları sergilerler: hızlı sabitleme<sup&gt; 1,2</sup&gt; Photobleaching azaltılmış<sup&gt; 3</sup&gt; Ve cryo-EM önce örnek bütünlüğünü tarama<sup&gt; 4,5</sup&gt; Ya da kimyasal tespiti / gömme<sup&gt; 6</sup&gt;. Cryo-EM veri toplama için darboğazlardan biri TEM örnek aktarımı ve görüntü uygun bölgelerde bulmak için ızgaranın her iki tarama için gerekli zaman. Cryo-LM hızlı veri toplama ile<sup&gt; 5</sup&gt; Zaman iyi hücreleri bulmak harcanan büyük ölçüde azaltılabilir. Böylece, hem zaman ve paradan tasarruf ve öncesi tarama ve cryo-LM ilgi alanlarının haritalanması bu darboğaz azaltmak.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Daha pahalı ya da karmaşık kriyojenik aşamalarında daha yüksek çözünürlüklü cryo-LM görüntüleme izin verebilir. Ancak, burada fabrikasyon aşamasında daha pek çok uygulama için yeterli. Cryo-LM görüntüleme ve örnek ızgara transferleri metin ve video açıklandığı gibi dikkatle yapılması halinde, tam kirlenme ücretsiz görüntüleme yapılabilir. Bu yöntem, aynı hücre, organel ya da makromoleküler kompleksi floresan ve elektron mikroskobu verileri doğrudan bir ilişki karbon destek dağınık ya da ince bir doku bölümünde içinde yer sağlar<sup&gt; 7</sup&gt;. Bu kriyojenik sahne değer bir bütün olarak ışık mikroskobu alanına cryo-LM/cryo-EM korelatif çalışmaların ötesine uzanan dikkat edilmelidir. Bu kriyojenik aşamada hassas örnekleri ve fluorofor boyalar / lekeleri için uygundur<sup&gt; 8</sup&gt; Quantum noktaları veya floresan etiketli proteinlerin<sup&gt; 9</sup&gt; Paraformaldehid glutaraldehit ve oda sıcaklığında kimyasal fiksasyon ve gömme sırasında kararsız olabilir. Sonuç olarak, biz bu kriyojenik aşamada, önce maliyet ve yetersiz erişim deterred edilmiştir cryo-LM, ilgilenenler daha yüksek erişim sağlayacağını umuyorum.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Sorun Giderme Cryo-Işık Mikroskopi</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Örnek Adsorpsiyon:</em&gt; Farklı örnekleri karbon destek değişken adsorbsiyon özellikleri gösterebilir. Destek ızgaraları gibi sürekli karbon, holey karbon veya numune desteği için formvar kaplı ızgaraları gibi diğer türleri kullanmak gerekli olabilir. Ayrıca, örnek ızgara ve karbon yüzey bakır çubuk bağlayıcı ise, karbon yüzey kimyası, ızgara ıslatıcı ile inkübe veya parlaklık örnek ek önce boşaltma ayarlamak için gerekli olabilir.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Sahne istikrar:</em&gt; Titreşim fark ederseniz, büyük olasılıkla ağırlığı yerine LN2 köpürme aşırı örnek aşamasına kaynaklanmaktadır. Kriyojenik aşamada ek bir ağırlık, bazen düşük frekanslı titreşimleri, standart 3-eksenli seyahat mikroskop sahne boyunca iletmek için neden ve bulanıklık aracılığıyla görüntüleme olumsuz etkileyebilir. Bu videoda gösterildiği gibi, mikroskop altında çift vida silah ile ayarlanabilir bir mini asansör veya ayarlanabilir bir adaptör ile seyahat aşamasında destekleyen kolayca düzeltilebilir. Her ikisi de bu ayarlanabilir destek mekanizmaları seyahat aşamasında olmayan bir hareketli kısmı ile etkileşime girer ve bu nedenle hala görüntüleme için gerekli olarak X ve Y ekseni çeviri izin verir.</p

Özel reaktifler ve ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th><th> Maliyet </th></tr><tr><td> 1 - 22,86 cm (9 &quot;) eğimli kenarı ile pasta tava </td><td> İyi Cook </td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 4,39 $ </td></tr><tr><td> 1 - 22,86 cm (9 &quot;) kek tava </td><td> İyi Cook </td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 4,93 $ </td></tr><tr><td> Çubuklarını, 4 çift </td><td></td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 0,50 $ </td></tr><tr><td> 1 - Büyük sayfalar sprey köpük </td><td> Büyük sayfalar </td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 5,98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm x1cm alüminyum blok </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan veya metal hurda bahçesinde </td><td> $ 10.00 </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 cm (3 / 4 &quot;) düz başlı civatalar w / fındık oluklu </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 3 - # 4: 0.95 cm (3 / 8 &quot;) Yivli cıvata w / fındık </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 pullar </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 2 - şeffaf plastik clipboards </td><td></td><td></td><td> Yerel ofis mağaza </td><td> 6,84 $ </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM grid sahibi </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM ızgara kutusu taşıma çubuğu </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 holey karbon film, 400-örgü bakır cryo-EM destek ızgara </td><td> SPI Malzemeleri </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Deneysel malzemeleri <ol><li> Maya zorlama: Hta1-CFP: Kaplan laboratuar KanMX6: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 Hta1-CFP: UC Davis). </li><li> Cryo-Işık Mikroskopi: Cryo-ışık mikroskobu görüntüleri Leica DFC310 FX CCD kamera ile Leica DM4000M yansıtan mikroskop alındı. Parlak Alan, Karanlık Alan ve Floresans görüntüleri ya HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 NA hava amacı, bir HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 NA hava amacı, PL FLUOTAR 50x 0.55 NA hava amacı veya NPLAN 100x 0.75 NA hava amacı ile satın alındı. Parlak Alan ve Dark Alan görüntüler, ışık kaynağı olarak 12V 100W tungsten lamba kullanılır. Filtre Küp Floresans için bir EL6000 UV lamba kaynağı Leica JC1 (BP 480/30 DM LP 505, SF BP 535/40 ve LP 580 Ex.F.) ile birlikte kullanılır. </li><li> Cryo-Transmisyon Elektron Mikroskopi: Cryo-EM görüntüler Gatan 626 cryo-devret tutucu (Gatan ABD) kullanan 200 keV bir JEM-2100-FEG Transmisyon Elektron Mikroskobu (JEOL, Japonya) işletim satın alındı. Mikroskobu, 50, 200, 1.200 ve 4.000 x 4.096 x 4.096 piksel Tietz CCD kamera (TVIPS, Gauting, Almanya) nominal büyütmelerde kaydedildi. </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

Cryo ışık mikroskobu (cryo-LM) ve kriyo-elektron mikroskobu kavrama (cryo-EM) hücresel dinamikleri ve ultrastrüktür anlamak için bir çok avantaj teşkil etmektedir. İlk olarak, hücreler her iki teknikleri için yakın bir doğal ortamda görüntülü olabilir. Vitrifikasyon süreci nedeniyle, ikinci numunelerin hızlı fiziksel immobilizasyon ziyade yavaş kimyasal sabitleme tarafından korunur. Üçüncü olarak, görüntüleme cryo-LM ve cryo-EM ile aynı örnek, &quot;temsili numuneler&quot; bir karşılaştırma yerine, tek bir hücre veri korelasyon sağlar. Bu faydalar, önceki çalışmalardan elde edilen iyi bilinen edilirken, bağlaşık cryo-LM ve cryo-EM kalır yaygın kullanımı, satın alma ya da uygun bir kriyojenik ışık mikroskobu sahne binasının gider ve karmaşıklığı nedeniyle sınırlı. Burada montaj göstermek ve yerel donanım ve bakkallarda bulunan parçalar ile 40 $ &#39;dan az herhangi bir laboratuarda imal edilebilir bir ucuz kriyojenik sahne kullanımı. Bu cryo-LM aşaması uzun çalışma mesafesi hava hedefleri ile donatılmış yansıyan ışık mikroskopları ile kullanmak için tasarlanmıştır. Bağıntılı cryo-LM ve cryo-EM çalışmaları için, biz örnek destekleyen olarak karbon kaplı standart 3 mm cryo-EM ızgaraları kullanmak uyum sağlar. Izgara örnek adsorblama sonra, örnek sırlama ve aktarma / ızgara taşınması için daha önce belirlenmiş protokoller çok tekniği görüntüleme izni için takip edilmektedir. Sonuç olarak, bu kurulum yansıyan bir ışık mikroskobu ile, herhangi bir laboratuvar dondurulmuş sulu örneklerin doğrudan bağıntılı görüntüleme erişim sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy at JoVE.com

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Biz en çok yansıyan ışık mikroskopları uyacak şekilde tasarlanmış düşük maliyetli kriyojenik sahne imalat göstermektedir. Bu laboratuvar dahili kriyojenik aşamada cryo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu arasındaki verimli ve güvenilir bir bağlaşık görüntüleme sağlar.

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Sıvı Enjeksiyon için 3D Baskılı Kalıpları Kullanma Tıbbi Cihazlar hızlı ve düşük maliyetli Prototip

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Bir Açık Kaynak Tasarımı, Düşük Maliyetli Bioink ve Gıda Melt Extrusion 3D Yazıcı

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...