Name: a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

De auteurs willen dr. Lan Yi, Cancer Institute van de New Jersey, bedanken voor technische bijstand bij de voorbereiding van weefsel manden. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health Subsidies DK083425 en DK070219.

1. Synthese van een digoxigenine-11-UTP-gemerkte Riboprobe van een PCR gegenereerde Template <ol><li> Te synthetiseren een gen-specifieke riboprobe, gebruik Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) om het gen cDNA referentie sequentie (RefSeq) te verkrijgen. Gebruik de Primer3 programma (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 tot gen-specifieke PCR-primers ontwerp ten opzichte van de 3&#39;-gebied van de cDNA-sequentie. Aanbevolen parameters voor PCR-primer selectie zijn elders beschreve...

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

Met behulp van de hier beschreven methode, is het mogelijk om mRNA te detecteren in alle belangrijke soorten cellen en weefsels compartimenten van de foetale mannelijke en vrouwelijke muizen LUT&#39;s mogelijk is inclusief de mesenchymale pads, urotheel, glad spierweefsel, prostaat knoppen, ejaculatie kanaal, en de vagina. De 50μm secties die in dit protocol hebben het voordeel dat ze dik genoeg zijn om weefsel architectuur (zoals de bloedvaten) op te lossen, maar zijn dun genoeg om te probe vangen, dat is een methodol...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Anti-digoxigenine antilichaam, Fab-fragmenten </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Het blokkeren van reagens </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Purple AP substraat, precipiterende </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Celcultuur plaat, 24 goed </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenine 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Tweesnijdend scheermesje </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klassieke Model </td></tr><tr><td> Eliminase RNase remover </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gelextractiekit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaaraldehyde, 25% oplossing in H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparine, natriumzout </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Waterstofperoxide, 30% oplossing in H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 snelle installatie Snellijm </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnesiumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleïnezuur </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Reactievaatjes, 1,5 ml </td><td> Biologix Research Company </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell cultuur plaat te voegen </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Moleculaire slijpen hars </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, 4% oplossing in fosfaat-gebufferde zoutoplossing </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, zonder Ca &amp; Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Kleine onderdelen Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K oplossing, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Columns </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q-oplossing </td><td> Qiagen </td><td> Voorzien van Taq DNA-polymerase </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase-remmer </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase-vrij DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque low-melt agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Schapen serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfon, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Natriumazide, korrelige </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X oplossing </td><td> Research Products International </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> SuperScript III eerste streng synthese systeem </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA-polymerase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA-polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrerende microtoom met een luxe exemplaar bad </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Gist tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

De ontwikkeling van het lagere urogenitale tractus (LUT) is een ingewikkeld proces. Deze complexiteit blijkt tijdens de vorming van de prostaat van de foetus mannelijk urethra, die zich baseert op androgene signalen en epitheliale-mesenchymale interacties 1,2. Inzicht in de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de prostaat ontwikkeling kan uitwijzen groei mechanismen die ten onrechte zijn later in hun leven opnieuw tot leven gewekt om aanleiding te geven tot prostaat ziekten zoals benigne prostaathyperplasie en prostaatkanker. De ontwikkelingslanden LUT is anatomisch complex. Tegen de tijd dat de prostaat ontluikende begint op 16,5 dagen na de conceptie (DPC), een groot aantal celtypen aanwezig zijn. Vaatstelsel, de zenuwen en het gladde spierweefsel verblijven binnen de mesenchymale stroma 3. Dit stroma omringt een meerlagig epitheel en geeft aanleiding tot de foetale prostaat via androgeenreceptor-afhankelijk paracriene signalen 4. De identiteit van de stromale androgeenreceptor-responsieve genen die nodig zijn voor de prostaat ontwikkeling en het mechanisme waarmee de prostaat ductaal epitheel vormen in reactie op deze genen niet volledig begrepen. De mogelijkheid om nauwkeurig te identificeren en te lokaliseren soorten cellen de expressie van specifieke factoren in hen is noodzakelijk om verder te begrijpen prostaat ontwikkeling. In situ hybridisatie (ISH) zorgt voor lokalisatie van mRNA&#39;s in een tissue. Zo kan deze methode worden gebruikt voor het patroon en de timing van expressie van signaalmoleculen en hun receptoren te identificeren, waardoor het ophelderen van de potentiële prostaat ontwikkeling toezichthouders. We beschrijven hier een hoge doorvoersnelheid ISH techniek om mRNA expressie patronen te identificeren in de foetale muis LUT met behulp van trillende microtoom gesneden secties. Deze methode biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere ISH protocollen. Het uitvoeren van ISH op dunne secties gehandeld op grond van een dia is technisch moeilijk, vriescoupes hebben vaak een slechte structurele kwaliteit, terwijl zowel de vriescoupes en paraffinecoupes resulteren vaak in een zwak signaal resolutie. Het uitvoeren van ISH op hele berg weefsel kan resulteren in een probe vangen. In tegenstelling tot onze high throughput techniek maakt gebruik van dik gesneden secties die gedetailleerde weefsel architectuur zichtbaar te maken. Gewijzigd microfugebuizen buizen een gemakkelijke bediening mogelijk van onderdelen tijdens de ISH procedure. Er kunnen maximaal 4 mRNA transcripten kan worden afgeschermd van een enkele 17.5dpc LUT met maximaal 24 mRNA transcripten gedetecteerd in een enkele run, waardoor de kosten en het maximaliseren van efficiency. Met deze methode kunnen meerdere behandelingsgroepen tot identiek en als een geheel worden verwerkt, zodat er geen voorkeur voor het interpreteren van data. De meeste pertinent voor prostaatkanker onderzoekers, deze methode zorgt voor een ruimtelijke en temporele locatie van de lage en hoge overvloed mRNA transcripten in de foetale muis urinebuis die aanleiding geeft tot de prostaat ductaal netwerk.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

We beschrijven hier een efficiënte high throughput<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (ISH) methode voor het visualiseren van patronen van mRNA-expressie in de ontwikkeling van de foetus muis prostaatweefsel secties. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan de mRNA expressie patronen visualiseren in andere muis weefsels of in de weefsels van andere diersoorten.

Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...