Name: a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lan Yi, Cancer Institute of New Jersey, um technische Unterstützung zu danken, bei der Vorbereitung Gewebe Körbe. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants DK083425 und DK070219 finanziert.

1. Synthese eines Digoxigenin-11-UTP-markierten Riboprobe aus einer PCR-Generated-Vorlage <ol><li> Zur Synthese eines Gens spezifischen Ribosonde, verwenden Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), um das Gen cDNA Referenzsequenz (RefSeq) zu erhalten. Verwenden Sie die Primer3 Programm (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 bis genspezifischen PCR-Primer gegen die 3&#39;-Region der cDNA-Sequenz-Design. Empfohlene Parameter für PCR-Primer Auswahl an anderer Stelle (http://www.gudmap.or...

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

Mit dem hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, mRNAs in allen wichtigen Zelltypen und Gewebe Fächer des fetalen männlichen und weiblichen Mäusen LUTs inklusive der mesenchymalen Pads, Urothel, glatte Muskelzellen, Prostata-Knospen, Ductus ejaculatorius und Vagina zu erkennen. Der 50 um Abschnitte in diesem Protokoll haben den Vorteil, dass dick genug, um Gewebe-Architektur (z. B. Blutgefäße) zu lösen, sind aber dünn genug, um Sonde Trapping, die ein methodisches Problem häufig während der gesamten ISH-mo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-Antikörper, Fab-Fragmente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Lila AP Substrat, Ausfällen </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Zellkulturplatte, 24 und </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Zweischneidige Rasierklinge </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klassisches Modell </td></tr><tr><td> Eliminase RNase-Entferner </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd, 25% ige Lösung in H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparin, Natriumsalz </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid, 30% ige Lösung in H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 schnelle Einrichtung Sekundenkleber </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleinsäure </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäße, 1,5 ml </td><td> Biologix Research Company </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell Kultur Platte einfügen </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Molecular Anreibeharz </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, 4% ige Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung, ohne Ca und Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester Mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Kleinteile Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K-Lösung 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Columns </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q-Lösung </td><td> Qiagen </td><td> Ausgestattet mit Taq DNA Polymerase </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase-Inhibitor </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase-freie DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Low-Melt Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Sheep Serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup Filtereinheit, 0,22 &amp;mgr; m, Polyethersulfon, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Natriumazid, körnige </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X-Lösung </td><td> Forschung Products International </td><td> S24022-4000,0 </td></tr><tr><td> SuperScript III Erststrangsynthese System </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrating Mikrotom mit Deluxe-Exemplar Bad </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Hefe tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

Entwicklung des unteren Urogenitaltraktes (LUT) ist ein komplizierter Vorgang. Diese Komplexität wird während der Bildung der Prostata aus dem fötalen männlichen Harnröhre, die auf androgene Signale und epithelial-mesenchymale Interaktionen 1,2 stützt belegt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für Prostata-Entwicklung kann sich herausstellen, Wachstum Mechanismen, die unangemessen wiedererweckt werden später im Leben zu steigen, um Prostataerkrankungen, wie gutartige Prostata-Hyperplasie und Prostatakrebs geben. Die Entwicklung von LUT ist anatomisch komplexer. Zu der Zeit, Prostata angehende beginnt auf 16,5 Tage nach der Empfängnis (DPC), sind zahlreiche Zelltypen vor. Gefäßsystem, Nerven und glatten Muskelzellen in den mesenchymalen Stromazellen 3 befinden. Das Stroma umgibt ein mehrschichtiges Epithel und gibt Anlass zu der fetalen Prostata durch Androgen-Rezeptor-abhängige parakrine Signale 4. Die Identität der Stroma-Androgen-Rezeptor-responsive Gene für Prostata-Entwicklung und der Mechanismus, mit dem Prostata-duktalen Epithel bildet in Reaktion auf diese Gene nicht vollständig verstanden erforderlich. Die Fähigkeit, genau zu identifizieren Zelltypen und zu lokalisieren Expression spezifischer Faktoren in ihnen ist zwingend notwendig, um weiter zu verstehen Prostata Entwicklung. In-situ-Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Lokalisierung von mRNAs in einem Gewebe. Somit kann diese Methode verwendet, um Muster und Timing der Expression von Signalmolekülen und ihren Rezeptoren zu identifizieren, damit die Aufklärung potenzieller Prostata Entwicklungsregulatoren werden. Hier beschreiben wir einen hohen Durchsatz ISH Technik, um mRNA-Expressionsmuster in der fetalen Maus LUT mit vibrierenden Mikrotom-Zuschnitte zu identifizieren. Diese Methode bietet einige Vorteile gegenüber anderen ISH-Protokolle. Performing ISH am dünne Schnitte verklebt, um eine Folie ist technisch schwierig, Kryoschnitten haben häufig schlechte bauliche Qualität, während sowohl Gefrierschnitte und Paraffinschnitte oft in schwachen Signal Auflösung führen. Performing ISH auf whole mount Gewebe können in der Sonde Trapping führen. Im Gegensatz dazu nutzt unsere Hochdurchsatz-Technik dick geschnittenen Abschnitte, die detaillierte Gewebe Architektur offenbaren. Geändert Mikrozentrifugenröhrchen ermöglichen eine einfache Handhabung der Teile während der ISH Verfahren. Es können maximal 4 mRNA-Transkripte können von einem einzigen 17.5dpc LUT mit bis zu 24 mRNA-Transkripte in einem einzigen Durchlauf erkannt abgeschirmt werden, wodurch Kosten und Maximierung der Effizienz. Diese Methode ermöglicht es mehreren Behandlungsgruppen identisch und als eine Einheit verarbeitet werden, wodurch eine Tendenz für die Interpretation der Daten. Die meisten treffend für Prostata-Forscher, stellt diese Methode eine räumliche und zeitliche Lage der niedrigen und hohen Fülle mRNA-Transkripte in der fetalen Maus Harnröhre, die Anlass zu der Prostata duktalen Netzwerk.

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A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Hier beschreiben wir eine effiziente Hochdurchsatz-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (ISH)-Methode zur Visualisierung von Mustern der mRNA-Expression in der Entwicklung fetalen Maus Prostatagewebe Abschnitten. Die Methode kann leicht angepasst werden, um mRNA-Expressionsmuster in anderen Maus Gewebe oder in Gewebe von anderen Arten zu visualisieren.

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Forschung

Biologie

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Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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