Name: a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר לאן יי, מכון הסרטן של ניו ג&#39;רזי, לקבלת סיוע טכני בהכנת סלי רקמות. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים DK083425 ו DK070219.

1. סינתזה של Riboprobe Digoxigenin-11-UTP שכותרתו מתבנית PCR שנוצר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסנתז riboprobe גן ספציפי, השתמש Entrez ג&#39;ין (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) כדי לקבל את התייחסות cDNA רצף הגן (RefSeq). השתמש בתוכנית Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 לעיצוב הגן ה?...

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

באמצעות השיטה המתוארת כאן, אפשר לזהות mRNAs בכל סוגי התאים העיקריים תאים ורקמות של LUTs עוברי עכבר זכר ונקבה כולל רפידות mesenchymal, urothelium, שרירים חלקים, בלוטות הערמונית, צינור השופכה, והנרתיק. הסעיפים 50μm להשתמש בפרוטוקול זה יש את היתרון של להיות עבה מספיק כדי לפתור ארכיטקטור?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin נוגדן, שברי Fab </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> חסימת מגיב </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM המצע סגול AP, מזרז </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> תרבות צלחת Cell, 24 גם </td><td> קורנינג </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> פיפיות גילוח להב </td><td> ווילקינסון חרב </td><td> דגם קלאסי </td></tr><tr><td> Eliminase מסיר RNase </td><td> Decon מעבדות </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> לפוראמיד </td><td> סיגמא </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> ג&#39;ל ערכת חילוץ </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> , Glutaraldehyde פתרון של 25% H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> G6257-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> הפרין, מלח נתרן </td><td> סיגמא </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> מי חמצן, פתרון של 30% H 2 O </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisole </td><td> סיגמא </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 לקבוע מיידית דבק מהיר </td><td> הנקל קורפ </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> M0375-500 גרם </td></tr><tr><td> Microcentrifuge צינורות, 1.5mL </td><td> Biologix חברת המחקר </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> צלחת Millicell תרבות להכניס </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> שרף שחיקה מולקולרית </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> , Paraformaldehyde פתרון 4% פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים, ללא Ca &amp; Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> רשת פוליאסטר, 33 מיקרון, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> חלקים קטנים Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K פתרון, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> QIAshredder עמודות </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> ש פתרון </td><td> Qiagen </td><td> מסופק עם ה-DNA פולימראז תקי </td></tr><tr><td> RNase </td><td> סיגמא </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase המעכב </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy מיני ערכת </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNEASY מיני ערכת </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase ללא DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque נמוכה להמיס agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> כבשים בסרום </td><td> סיגמא </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup יחידת הסינון, 0.22μm, polyethersulfone, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> אזיד הנתרן, פרטנית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Dodecyl נתרן גופרתי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X פתרון </td><td> מחקר מוצרים הבינלאומי </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> עילי III הראשונה גדיל סינתזה מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA פולימראז </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> תקי פולימראז ה-DNA </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> טריס-HCl </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> רטט microtome עם אמבטיה הדגימה דלוקס </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> שמרים tRNA </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

פיתוח בדרכי השתן ואברי המין התחתון (LUT) הוא תהליך מורכב. מורכבות זו לידי ביטוי במהלך היווצרות של הערמונית של השופכה בעובר זכר, אשר מסתמכת על אותות androgenic ו אפיתל-mesenchymal 1,2 אינטראקציות. הבנת המנגנונים המולקולריים האחראים להתפתחות סרטן הערמונית עשוי לחשוף את מנגנוני צמיחה, כי הם לא הולם המתעורר בשלב מאוחר יותר בחיים לעורר מחלות הערמונית כגון היפרפלזיה שפירה של הערמונית וסרטן הערמונית. LUT פיתוח מורכב מבחינה אנטומית. על ידי הערמונית זמן ניצני מתחיל על התפיסה ימים 16.5 פוסט (DPC), סוגי תאים רבים נוכחים. בכלי הדם, העצבים שריר חלק מתגוררים בתוך stroma mesenchymal 3. Stroma זה המקיף אפיתל רב שכבתי ואת מוליד הערמונית העובר דרך קולטן האנדרוגן תלויים אותות אוטוקריני 4. זהותם של קולטן האנדרוגן סטרומה תגובה הגנים הדרושים לפיתוח הערמונית את המנגנון שבאמצעותו הערמונית צורות ductal אפיתל בתגובה הגנים האלה לא מובנת לחלוטין. היכולת לזהות במדויק סוגי תאים בתרגום הביטוי של גורמים ספציפיים בתוך אותם הוא הכרחי כדי להבין את התפתחות נוספת הערמונית. הכלאה In situ (שאני עורך) מאפשר איתור של mRNAs בתוך הרקמה. לכן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות דפוס והעיתוי של ביטוי של מולקולות איתות הקולטנים שלהם, ובכך הבהרת הרגולטורים הערמונית הפוטנציאל ההתפתחותי. כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה שאני עורך טכניקה לזהות דפוסי ביטוי mRNA ב LUT העכבר העובר באמצעות רטט microtome לחתוך חלקים. שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני פרוטוקולים אחרים שאני עורך. ביצוע שאני עורך על סעיפים דק דבק שקופית קשה מבחינה טכנית, cryosections לעתים קרובות יש איכות מבנית העניים בעוד הן cryosections וחתכים פרפין לעיתים לגרום ברזולוציה אות חלש. ביצוע שאני עורך על כל רקמות הר יכול לגרום השמנה בדיקה. לעומת זאת, הטכניקה תפוקה גבוהה שלנו מנצל עבה לחתוך קטעים החושפים ארכיטקטורת רקמה מפורט. צינורות microfuge השתנה לאפשר טיפול קל סעיפים במהלך ההליך איש. מקסימום של 4 תעתיקי mRNA יכול להיות מוקרן מן LUT 17.5dpc יחיד עם עד 24 תעתיקי mRNA זוהה בטווח יחיד, ובכך להפחית את עלות ויעילות למקסם. שיטה זו מאפשרת לקבוצות טיפול מרובים כדי להיות מעובד ובשפה כיחידה אחת, ובכך להסיר כל הטיה של הנתונים לפרש. רוב לענייננו לחוקרים הערמונית, שיטה זו מספקת מיקום במרחב ובזמן של תעתיקי mRNA נמוך וגבוה בשפע השופכה עוברי עכבר אשר מעורר ברשת הערמונית ductal.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה ויעילה<em&gt; באתרו</em&gt; (שאני עורך) הכלאה שיטת הדמיה דפוסי ביטוי mRNA בפיתוח העובר הערמונית עכבר סעיפים רקמות. השיטה ניתן להתאים בקלות לדמיין ביטוי בדפוסי mRNA ברקמות העכבר אחרים או ברקמות ממינים אחרים.

תפוקה גבוהה באתרו הכלאה שיטה לאפיון דפוסי ביטוי mRNA של העכבר עוברית בדרכי השתן ואברי המין התחתון

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...