Name: a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00
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著者らは、組織のバスケットの準備に技術支援のために博士が蘭李、ニュージャージー州のがん研究所を、感謝したいと思います。この作品は、健康補助金DK083425とDK070219の国民の協会によって資金を供給された。

1。 PCR -生成されたテンプレートからジゴキシゲニン- 11 - UTP -標識リボプローブの合成<ol><li>遺伝子特異的リボプローブを合成するには、遺伝子cDNAの参照配列（RefSeqデータベース）を取得するためにEntrezの遺伝子を（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）を使用します。 cDNA配列の3&#39;末端領域に対する遺伝子特異的PCRプライマーを設計するPrimer3のプログラム（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/?...

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

方法ここで説明を使用して、それは間葉系パッド、尿路上皮、平滑筋、前立腺芽、射精管、および膣を含む胎児の雄と雌のマウスのLUTの主要な細胞型と組織区分のすべてのmRNAを検出することが可能である。このプロトコルで使用さ50μmのセクションでは、組織のアーキテクチャ（例えば、血管など）を解決するために十分な厚さという利点を持っていますが、一般的にホールマウントISH中に?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン抗体、Fabフラグメント</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BMパープルAP基質、沈澱</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP1600 - 100 </td></tr><tr><td>細胞培養用プレート、24ウェル</td><td>コー​​ニング</td><td> 3524 </td></tr><tr><td>ジゴキシゲニン11 - UTP </td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPの</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td>両刃のカミソリの刃</td><td>ウィルキンソンソード</td><td>古典的なモデル</td></tr><tr><td> Eliminase RNaseの除去</td><td> Decon研究所</td><td> 1102 </td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F5786 - 1L </td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>キアゲン</td><td> 28704 </td></tr><tr><td> H 2 Oにおけるグルタルアルデヒド、25％溶液</td><td>シグマ</td><td> G6257 - 100ML </td></tr><tr><td>ヘパリン、ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> H3393 </td></tr><tr><td> H 2 O中の過酸化水素、30％溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP2633 - 500 </td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>シグマ</td><td> L9756 </td></tr><tr><td>ロックタイト404クイックセットの瞬間接着剤</td><td>ヘンケル（株） </td><td> 46551 </td></tr><tr><td>マグネシウムの塩化</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>シグマ</td><td> M0375 - 500G </td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、1.5mlの</td><td> Biologix調査会社</td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td> Millicell培養プレートインサート</td><td>ミリポア</td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td>分子研削樹脂</td><td> G -バイオサイエンス</td><td> 786 - 138PR </td></tr><tr><td>リン酸のパラホルムアルデヒド、4％溶液は、緩衝食塩水</td><td>アフィメトリクス</td><td> 19943 </td></tr><tr><td>リン酸塩は、Ca及びMgをすることなく、緩衝食塩水</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td>ポリエステルメッシュ、33ミクロン、12&quot;× 24&quot; </td><td>小さな部品株式会社</td><td> CMY - 0033 - D </td></tr><tr><td>プロテイナーゼKソリューション、20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195 - 5mlの</td></tr><tr><td> QIAshredderカラム</td><td>キアゲン</td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Qのソリューション</td><td>キアゲン</td><td> Taq DNAポリメラーゼに付属されています</td></tr><tr><td> RNaseの</td><td>シグマ</td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase阻害剤</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNaseフリーのDNase </td><td>プロメガ</td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque低融点アガロース</td><td>ロンザ</td><td> 50101 </td></tr><tr><td>ヒツジ血清</td><td>シグマ</td><td> S2263 - 500mLに</td></tr><tr><td> Stericupフィルタユニット、0.22μm、ポリエーテルスルホン、500ミリリットル</td><td>ミリポア</td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td>粒状のアジ化ナトリウム、 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S227I - 100 </td></tr><tr><td>ナトリウム塩化</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP358 - 212 </td></tr><tr><td>硫酸ドデシルナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S529 - 500 </td></tr><tr><td> SSC、20Xソリューション</td><td>研究プロダクツ国際</td><td> S24022 - 4000.0 </td></tr><tr><td>スーパースクリプトIII第一鎖合成システム</td><td>インビトロジェン</td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNAポリメラーゼ</td><td>キアゲン</td><td> 201203 </td></tr><tr><td>トリス塩酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP153 - 1 </td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td>デラックスの試料槽と振動ミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> VT1000A </td></tr><tr><td>酵母tRNA </td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

下部尿生殖路（LUT）の開発は複雑なプロセスです。この複雑さは、アンドロゲンシグナルと上皮-間葉相互作用の1,2に依存している胎児の男性の尿道から前立腺の形成の間に証明されています。前立腺の開発を担当する分子メカニズムを理解することは不適切にそのような良性前立腺肥大症や前立腺癌などの前立腺疾患を生じさせるために、その後の人生に呼び覚ますされている成長メカニズムを明らかにすることがあります。 開発LUTは、解剖学的に複雑です。出芽時の前立腺は16.5日後の構想（DPC）で始まることにより、多数の細胞タイプが存在する。血管系、神経や平滑筋は、間葉系間質3内に存在する。この基質は、多層上皮を囲み、アンドロゲン受容体依存性傍分泌シグナル4を介して胎児の前立腺を生じさせる。前立腺の開発とこれらの遺伝子に対応して前立腺管の上皮の形態は完全には理解されていないメカニズムのために必要な間質アンドロゲン受容体応答性遺伝子のアイデンティティ。正確に細胞の種類を識別し、それらの内の特定の因子の発現をローカライズする機能は、さらに前立腺の開発を理解することが不可欠です。in situハイブリダイゼーション （ISH）組織内のmRNAの局在化が可能になります。したがって、このメソッドは、それによって潜在的な前立腺の発達レギュレータの解明、シグナル分子とその受容体の発現のパターンとタイミングを識別するために使用することができます。 ここで、我々は、振動ミクロトームカットのセクションを使用して、胎児マウスのLUTでmRNAの発現パターンを識別するために、高スループットのISH法を説明します。このメソッドは、他のISHのプロトコルに比べていくつかの利点があります。スライドに付着した薄い切片上でISHを実行すると、技術的に困難であり、凍結切片やパラフィン切片の両方がしばしば弱い信号の解像度をもたらす間、凍結切片は、頻繁に悪い構造の品質を持っている。全体のマウント組織でISHを実行すると、プローブのトラッピングが発生する可能性があります。対照的に、私たちのハイスループット技術は、詳細な組織構造を明らかに分厚く切ったセクションを利用しています。修正されたマイクロチューブは、ISH手順の実行中にセクションを簡単に処理できます。 4 mRNAの転写産物の上限は、それによってコストと最大化効率を減少させる、一度の実行で検出された24のmRNA転写産物を最大で単一の17.5dpc LUTからスクリーニングすることができる。このメソッドは、それによってデータを解釈するための任意のバイアスを除去し、同じ単一のユニットとして処理される複数の治療群を可能にします。最も適切に前立腺の研究者のために、この方法では、前立腺管のネットワークを生じる胎児マウスの尿道が低く、高い多量のmRNA転写物の空間的、時間的な場所を提供します。

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A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

ここで、我々は、効率的な高スループットを記述<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（ISH）胎児マウスの前立腺組織切片を開発する際にmRNAの発現のパターンを可視化するための方法。方法は簡単に他のマウスの組織でまたは他の種から採取した組織中のmRNAの発現パターンを可視化するために適応させることができます。

ハイスループットその場で</em胎児マウス下部尿生殖路のmRNAの発現パターンを特徴づける>ハイブリダイゼーション法

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

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ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

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ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

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全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

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放射性その場で</em組織における多様な遺伝子発現パターンを検出するための>ハイブリダイゼーション

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High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

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自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

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リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

ハイスループットその場でハイブリダイゼーション法