Name: a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lan Yi, Cancer Institute de Nova Jersey, para assistência técnica na preparação de cestas de tecido. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde DK083425 e DK070219.

1. Síntese de uma Riboprobe digoxigenina-11-UTP-identificadas a partir de um modelo de PCR-Generated <ol><li> Para sintetizar uma riboprobe gene específico, use Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) para obter o gene seqüência de referência cDNA (RefSeq). Use o programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 para projetar primers gene-específicos PCR contra a região 3&#39;-da seqüência de cDNA. Parâmetros recomendados para a seleção de primer PCR estão descritos ...

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

Usando o método descrito aqui, é possível detectar mRNAs em todos os principais tipos de células e dos compartimentos de tecido fetal do rato LUTs masculino e feminino, incluindo as almofadas mesenquimais, urotélio, o músculo liso, botões da próstata, ducto ejaculatório, e vagina. As seções 50 ìm utilizado neste protocolo tem a vantagem de ser grossa o suficiente para resolver arquitetura do tecido (como vasos sanguíneos), mas são finas o suficiente para evitar armadilhas sonda, que é um problema metodol?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Anticorpo anti-digoxigenina, fragmentos Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Bloqueio reagente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Roxo substrato AP, precipitando </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Placa de cultura de células, 24 bem </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenina 11 UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> De dois gumes lâmina de barbear </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Modelo clássico </td></tr><tr><td> Eliminase removedor de RNase </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel kit de extração </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Solução de glutaraldeído, 25% em H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparina, sal de sódio </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Solução de peróxido de hidrogênio, 30% em H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 adesivo instantâneo rápida set </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Ácido maleico </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml </td><td> Biologix Empresa de Pesquisa </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell inserir placa de cultura </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Resina de moagem Molecular </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Solução de paraformaldeído, 4% em tampão fosfato salino </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino, sem Ca e Mg </td><td> Biomedicals MP </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Peças pequenas Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K solução, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5mL </td></tr><tr><td> Colunas QIAshredder </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Solução Q </td><td> Qiagen </td><td> Fornecido com Taq DNA polimerase </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase inibidor </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy mini-kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNEASY mini-kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque baixo-melt agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Soro de ovelha </td><td> Sigma </td><td> S2263-500mL </td></tr><tr><td> Stericup unidade de filtro, 0.22μm, polietersulfona, 500mL </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Azida de sódio, granular </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X solução </td><td> Research Products International </td><td> S24022-4.000,0 </td></tr><tr><td> SuperScript III sistema de síntese de primeira fita </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrando com micrótomo deluxe banho espécime </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Levedura tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

Desenvolvimento do trato urogenital (LUT) é um processo complexo. Essa complexidade é evidenciada durante a formação da próstata a partir da uretra fetal masculino, que se baseia em sinais androgênicos e epitelial-mesenquimal 1,2 interações. Compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo desenvolvimento da próstata pode revelar os mecanismos de crescimento que são inadequadamente despertado mais tarde na vida para dar origem a doenças da próstata como a hiperplasia prostática benigna e câncer de próstata. A LUT desenvolvimento é anatomicamente complexa. Pelo tempo de brotamento da próstata começa na concepção pós 16,5 dias (DPC), numerosos tipos de células estão presentes. Vasculatura, nervos e músculos lisos residir no estroma mesenquimal 3. Este estroma envolve um epitélio multicamada e dá origem à próstata fetal através de receptor de andrógeno-dependentes sinais parácrinos 4. A identidade do receptor de andrógeno estroma-responsive genes necessários para a próstata desenvolvimento eo mecanismo pelo qual as formas de próstata epitélio ductal em resposta a esses genes não é totalmente compreendido. A capacidade de identificar com precisão os tipos de células e localizar a expressão de factores específicos dentro deles é imperativo para entender melhor o desenvolvimento da próstata. A hibridização in situ (ISH) permite a localização de mRNAs dentro de um tecido. Assim, este método pode ser usado para identificar padrões e tempo de expressão de moléculas sinalizadoras e seus receptores, elucidando assim reguladores de próstata potencial de desenvolvimento. Aqui, descrevemos uma técnica de ISH alta taxa de transferência para identificar padrões de expressão de mRNA na LUT rato fetal usando vibrando micrótomo de corte seções. Este método oferece diversas vantagens sobre outros protocolos de ISH. Realizar ISH em seções finas adere a um slide é tecnicamente difícil; criosecções freqüentemente têm qualidade estrutural pobres, enquanto ambos os criosecções e seções de parafina muitas vezes resultam em resolução do sinal fraco. Realizar ISH em tecidos todo suporte pode resultar em aprisionamento sonda. Em contraste, a nossa técnica de alto rendimento utiliza espessura de corte seções que revelam a arquitetura do tecido detalhadas. Tubos de microcentrífuga modificada permitir fácil manuseio das seções durante o procedimento ISH. Um máximo de 4 transcrições de mRNA podem ser rastreados a partir de um único LUT 17.5dpc com até 24 transcrições de mRNA detectados em uma única corrida, reduzindo custos e maximizando a eficiência. Este método permite que múltiplos grupos de tratamento para ser processado de forma idêntica e como uma única unidade, eliminando assim qualquer viés de interpretação dos dados. Mais pertinente para os pesquisadores de próstata, este método fornece uma localização espacial e temporal de transcritos mRNA baixa e alta abundância na uretra fetal do rato que dá origem à rede ductal da próstata.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Aqui, descrevemos uma produção eficiente de alta<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação método (ISH) para a visualização de padrões de expressão de mRNA no desenvolvimento fetal do rato secções de tecido da próstata. O método pode ser facilmente adaptado para visualizar padrões de expressão de mRNA nos tecidos dos camundongos outros ou em tecidos de outras espécies.

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biologia

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioativo In situ Hibridação para detecção de padrões de expressão dos genes nos tecidos diversos

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...