Name: a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

Författarna vill tacka doktor Lan Yi, Cancer Institute i New Jersey, för tekniskt bistånd för att förbereda vävnad korgar. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag DK083425 och DK070219.

1. Syntes av en Digoxigenin-11-UTP-märkta Riboprobe från en PCR-genererade Mall <ol><li> Att syntetisera en genspecifika riboprobe använder Entrez gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) för att erhålla den gen cDNA referens sekvens (RefSeq). Använd Primer3 programmet (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 att utforma genspecifika PCR mot 3&#39;-regionen av cDNA sekvensen. Rekommenderade parametrar för PCR primer urval beskrivs på annan plats (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/V...

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

Med hjälp av metoden som beskrivs här, är det möjligt att upptäcka mRNA i alla de stora celltyper och fack vävnad av fostrets manliga och kvinnliga musen LUT inklusive mesenkymala kuddar, urotel, glatt muskulatur, prostata knoppar, ejaculatorius kanal, och vagina. Den 50μm avsnitten i detta protokoll har fördelen av att vara tjock nog för att lösa vävnad arkitektur (t.ex. blodkärl) men är tunna nog för att undvika sond fångst, vilket är ett metodologiskt problem som ofta uppstår under hela-fäste ISH. V...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin antikropp, Fab-fragment </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Blockering reagens </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Lila AP substrat, utlösande </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Cellodling platta, 24 och </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Tveeggat rakblad </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klassisk modell </td></tr><tr><td> Eliminase RNas remover </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel utvinning kit </td><td> Qiagen </td><td> 28.704 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd, 25% lösning i H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100 ml </td></tr><tr><td> Heparin, natriumsalt </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Väteperoxid, 30% lösning i H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 snabbinställning Snabblim </td><td> Henkel Corp </td><td> 46.551 </td></tr><tr><td> Magnesiumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleinsyra </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Mikrocentrifugrör, 1,5 mL </td><td> Biologix forskningsföretag </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell odlingsplatta in </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Molekylär slipning harts </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, 4% lösning i fosfatbuffrad saltlösning </td><td> Affymetrix </td><td> 19.943 </td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning, utan Ca och Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Små delar Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinas K lösning 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ml </td></tr><tr><td> QIAshredder kolumner </td><td> Qiagen </td><td> 79.654 </td></tr><tr><td> Q-lösning </td><td> Qiagen </td><td> Försedd med Taq DNA-polymeras </td></tr><tr><td> RNas </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNas hämmare </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74.104 </td></tr><tr><td> RNEASY Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74.104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNas-fri DNas </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque låg smälta agaros </td><td> Lonza </td><td> 50.101 </td></tr><tr><td> Får serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup filterenhet, 0.22μm, polyetersulfon, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Natriumazid, granulat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> Rymdbolaget, 20X lösning </td><td> Forskning Products International </td><td> S24022-4000,0 </td></tr><tr><td> Upphöjd III första delen syntes systemet </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA-polymeras </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA-polymeras </td><td> Qiagen </td><td> 201.203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrerande mikrotom med Deluxe provet bad </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Jäst tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109.495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

Utveckling av den lägre urogenitalsystemet (LUT) är en invecklad process. Denna komplexitet styrks vid bildandet av prostata från fostrets manliga urinröret, som bygger på androgena signaler och epitelceller-mesenkymala interaktioner 1,2. Att förstå de molekylära mekanismer som ansvarar för prostata utveckling kan avslöja tillväxt mekanismer som olämpligt är återuppväckt senare i livet att ge upphov till prostata sjukdomar såsom godartad prostataförstoring och prostatacancer. Utvecklingsländerna LUT är anatomiskt komplex. Vid tiden prostatahyperplasi spirande börjar på 16,5 dagar efter befruktningen (DPC), många celltyper är närvarande. Kärlsystemet, nerver och glatt muskulatur finns inom de mesenkymala stroma 3. Detta glatta omger en mångbottnad epitel och ger upphov till fostrets prostatan genom androgenreceptorn-beroende parakrina signaler 4. Identiteten på den stromaceller androgen receptor-lyhörd gener som behövs för prostata utveckling och den mekanism genom vilken prostata duktal epitel former som svar på dessa gener är inte helt klarlagd. Förmågan att exakt identifiera celltyper och lokalisera uttrycket av specifika faktorer inom dem är absolut nödvändigt att ytterligare förstå prostata utveckling. In situ hybridisering (ISH) möjliggör lokalisering av mRNA i en vävnad. Därför kan denna metod användas för att identifiera mönster och tidpunkten för uttryck av signalering molekyler och deras receptorer, och därigenom belysa potentiella prostata utvecklande tillsynsmyndigheter. Här beskriver vi en hög teknik genomströmning ISH att identifiera mönster mRNA uttryck i fostrets musen LUT med vibrerande mikrotom-cut sektioner. Denna metod har flera fördelar jämfört med andra ISH protokoll. Utföra ISH på tunna delar iakttas en bild är tekniskt svårt, kryosnitt ofta har dålig strukturell kvalitet medan både kryosnitt och sektioner paraffin resulterar ofta i svag signal upplösning. Utföra ISH på hela berget vävnader kan resultera i sond svällning. Däremot använder vi hög genomströmning teknik tjockt skurna avsnitt som avslöjar detaljerad vävnad arkitektur. Ändrad mikrofugrör rör möjliggör enkel hantering av avsnitten under ISH förfarandet. Högst 4 mRNA transkript kan vara avskärmade från en enda 17.5dpc LUT med upp till 24 mRNA transkript detekteras i en enda körning, och därigenom minska kostnader och maximera effektiviteten. Denna metod gör att flera behandlingsgrupperna skall behandlas på samma sätt och som en enhet, och därmed undanröja någon bias för att tolka data. De flesta fog för prostata forskare, ger denna metod en tid och plats för låga och höga utskrifter överflöd mRNA i fostrets mus urinröret som ger upphov till prostatan duktal nätverk.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Här beskriver vi en effektiv hög genomströmning<em&gt; På plats</em&gt; Hybridisering (ISH) metod för att visualisera mönster av mRNA uttryck i utvecklingen av fostrets mus sektioner prostatavävnad. Metoden kan lätt anpassas för att visualisera mönster mRNA uttryck i andra mus vävnader eller i vävnad från andra arter.

En hög genomströmning På plats Hybridisering metod för att karaktärisera mönster mRNA uttryck i fostrets Mouse Lägre urogenitalsystemet

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

En hög genomströmning metod för att globalt studera organell morfologi i S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

En snabb hög kapacitet metod för kartläggning Ribonucleoproteins (RNPs) om mänskliga pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: En metod för att studera den tredimensionella arkitektur för ledare.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering för Upptäcka Diverse Mönster genuttryck i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...