Name: a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

Yazarlar doku sepet hazırlanmasında Dr Lan Yi, New Jersey Kanser Enstitüsü, teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeler DK083425 ve DK070219 Enstitüleri tarafından finanse edildi.

1. PCR oluşturuldu Şablon digoxigenin-11-UTP Etiketli Spastine Özgü Riboprop Sentezi <ol><li> Gen-spesifik bir Spastine Özgü Riboprop sentezlemek için, cDNA referans gen sekansı (RefSeq) elde etmek için Entrez Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) kullanın . CDNA dizisinin 3&#39;-bölge karşı gen-spesifik PCR primerleri tasarım Primer3 programı (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 kullanın. PCR primer seçimi için önerilen parametreler (http://www.gudmap.org/Research/Proto...

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

Burada anlatılan yöntemi kullanarak, tüm önemli hücre tipleri ve mezenkimal pedleri, ürotelium&#39;un, düz kas, prostat tomurcukları, ejakülasyon kanalı ve vajina da dahil olmak üzere fetal erkek ve dişi fare LUT doku bölmeleri mRNA&#39;ların tespit etmek mümkündür. Bu protokolde kullanılan 50μm bölümler, mimari dokusu (kan damarları gibi) çözmek için yeterli kalınlığa olmanın avantajı var ama yaygın tüm montaj ISH sırasında karşılaşılan metodolojik bir sorundur prob yakalama önlem...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Anti-digoxigenin antikor, Fab parçaları </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Reaktif Engelleme </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Mor AP substrat, presipite </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Hücre kültürü plaka iyi 24 </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> , Iki ucu keskin bir jilet bıçak </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klasik Model </td></tr><tr><td> Eliminase RNaz Remover </td><td> Decon Laboratuvarları </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Jel ekstraksiyon kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> H 2 O Glutaraldehyde,% 25 çözüm </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparin, sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> H 2 O Hidrojen peroksit,% 30 çözüm </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamizol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 hızlı ayarı anlık yapıştırıcı </td><td> Henkel A.Ş. </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleik asit </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj tüpler, 1.5mL </td><td> Biologix Araştırma Şirketi </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell kültür plaka eklemek </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Moleküler taşlama reçine </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehit,% 4 çözelti fosfat tamponlu salin </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Fosfat Ca ve Mg olmadan tamponlu salin </td><td> MP Biyomedikal </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester örgü, 33 mikron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Küçük Parça A.Ş. </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinaz K çözümü, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Sütunlar </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q çözümü </td><td> Qiagen </td><td> Taq DNA polimeraz ile Sağlanan </td></tr><tr><td> RNaz </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy minivan kiti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNEASY minivan kiti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNaz-ücretsiz DNaz </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque düşük erime agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Koyun serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup filtre ünitesi, 0.22μm, polyethersulfone, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Sodyum azid, taneli </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X çözüm </td><td> Araştırma Ürünler Uluslararası </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> Üst Simge III ilk iplikçik sentez sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA polimeraz </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Deluxe örnek banyo mikrotom Titreşimli </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Maya tRNA </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

Alt üriner sistem (LUT) geliştirilmesi, karmaşık bir süreçtir. Bu karmaşıklık, androjenik sinyalleri ve etkileşimleri 1,2 epitelyal-mezenkimal dayanmaktadır fetal erkek üretra, prostat oluşumu sırasında kanıtlanmıştır . Prostat gelişiminde sorumlu olan moleküler mekanizmaların anlaşılması uygunsuz prostat, benign prostat hiperplazisi ve prostat kanseri gibi hastalıklara yol açmaları daha sonra yaşamın yeniden canlanmasına sebep oldu büyüme mekanizmalarının ortaya çıkarabilir. Gelişmekte olan LUT anatomik olarak karmaşık. Tomurcuklanma zaman prostat 16.5 gün anlayışı (DPC) başlar, çok sayıda hücre tipleri mevcuttur. Damarları, sinirleri ve düz kas mezenkimal stroma 3 içinde bulunur. Bu çok katmanlı bir epitel stroma çevreleyen ve fetal androjen reseptör bağımlı parakrin sinyaller 4 ile prostata yol açmaktadır. Stromal androjen kimlik reseptör duyarlı prostat gelişiminde ve bu genlerin yanıt prostat duktal epitel formları tam olarak anlaşılmış değildir hangi mekanizma için gerekli olan genler. Yeteneği tam hücre tiplerinin tanımlanması ve bunların içindeki belirli faktörlerin ifade lokalize prostat gelişiminde daha fazla anlamak için şarttır. Situ hibridizasyon (ISH) bir doku içindeki mRNA&#39;ların lokalizasyonu için izin verir . Böylece, bu yöntem ve böylece potansiyel prostat gelişim düzenleyiciler nedenlerine açıklık, desen ve sinyal molekülleri ve bunların reseptörleri ifade zamanlaması tanımlamak için kullanılır. Burada, titreşimli mikrotom kesilmiş bölümler kullanarak fetal fare LUT mRNA desenleri tanımlamak için bir yüksek verim ISH tekniği açıklar. Bu yöntem diğer ISH protokolleri üzerinden birçok avantaj sunar. Bir slayt yapıştırılır ince bölümlerde ISH Sahne teknik olarak zor, hem cryosections ve parafin bölümleri genellikle zayıf sinyal çözünürlüğü neden cryosections sık sık kötü yapısal kalite var. Bütün montaj dokular üzerinde ISH Sahne prob yakalama neden olabilir. Buna karşın, yüksek kapasiteli tekniği ayrıntılı mimari dokusu ortaya kalın kesilmiş bölümler kullanır. Modifiye mikrofuge&#39;de tüpler ISH prosedürü sırasında bölümleri kolay kullanım sağlar. Ve böylece maliyet, maksimum verimlilik azaltarak, maksimum 4 mRNA transkript kadar tek bir çalışma tespit edilen 24 mRNA transkript ile tek bir 17.5dpc LUT gösterildi. Bu yöntem, birden fazla tedavi gruplarında böylece verileri yorumlamak için herhangi bir önyargı çıkarırken, aynı ve tek bir birim olarak işlenen sağlar. En pertinently prostat araştırmacılar için, bu yöntem, düşük ve yüksek bolluk mRNA transkript prostat duktal ağ sebebiyet veren fetal fare üretra mekansal ve zamansal bir konum sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli tarif<em&gt; In situ</em&gt; Fetal fare prostat doku bölümleri gelişmekte olan mRNA desenleri görselleştirmek için hibridizasyon (ISH) yöntemi. Bu yöntem diğer fare dokularda veya diğer türler dokularda mRNA ekspresyonu görselleştirmek için kolayca adapte olabilir.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi