Name: fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por una subvención (OPP1015402) de la Fundación Bill y Melinda Gates a través de la Iniciativa de Exploraciones de Grandes Desafíos, y por el NIH a través de subvenciones GM062958-01 y 2R01EB002046. Este trabajo fue realizado, en parte, bajo los auspicios del Departamento de Energía de EE.UU. por el Lawrence Livermore National Laboratory bajo el contrato DE-AC52-07NA27344.

1. Preparando el escenario <ol><li> Compra el ADN correspondiente, sin modificar químicamente la sonda de una empresa de oligonucleótidos de síntesis a medida tales como las tecnologías Biosearch (Novato, CA) o Certificado de Midland (Midland, TX). La sonda se modifica durante la síntesis de la adición de un tiol C6 en su extremo 3 &#39;y un azul de metileno redox-activa en su extremo 5&#39;. </li><li> Disolver el ADN de la sonda en tampón fosfato salino pH 7,4 a una concentración de 200 mM y verificar su concentración midiendo su absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro. Debido a la mitad de azul de metileno en la sonda de ADN, la solución debe tener un tinte azul visible. </li><li> Recién preparar 1 ml de una solución 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP en agua destilada, desionizada (DI-agua). En nuestra experiencia, estas soluciones TCEP se mantienen frescos durante una semana cuando se almacena en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Para reducir los puentes disulfuro que pueden estar presentes en la solución de ADN de la sonda, combine 1 l de la solución de la sonda de valores de ADN con 2 l de la solución TCEP y mezclar suavemente con una pipeta. Incubar la mezcla durante una hora en un recipiente oscuro, refrigerados. La solución inicialmente azul debe quedar claro que el TCEP reversible reduce el azul de metileno. Si la solución no queda claro, repita el procedimiento usando una solución TCEP fresco o, posiblemente, a temperatura ambiente. </li><li> Después de una hora se diluye la solución de ADN de la sonda reduce con 1 ml de solución tampón, lo que va a diluir a una concentración de 200 millas náuticas. Posteriormente, se incuba una serie de electrodos de disco de oro en porciones de 200 l de esta solución diluida de la sonda. </li><li> Recién preparar por lo menos 2 ml de 2 mm mercaptohexanol en tampón fosfato salino. </li></ol> 2. Sensor de preparación <ol><li> Combine 0,05 micras de polvo de aluminio con agua en un paño fino. Polaco una serie de electrodos de disco de oro (CH Instruments, Austin, TX) presionando la superficie de oro con firmeza en la tela húmeda, y moviéndolos en forma de ocho patrones durante aproximadamente tres minutos por cada electrodo. </li><li> Enjuague los electrodos pulido con DI-agua y sumerja en tubos Eppendorf rellenas con los mismos. Sonicar durante cinco minutos para eliminar cualquier polvo de alúmina residual. </li><li> Colocar los electrodos en una solución 0,5 M de ácido sulfúrico, la fijación a un potenciostato, junto con un contador de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia, y ejecutar una serie de voltamogramas para oxidar, reducir y electroquímicamente limpien sus superficies. Después de esto realizar una segunda limpieza electroquímico en una solución de 0,01 M de KCl en 0,1 M de ácido sulfúrico. Los detalles de estos procedimientos de limpieza se pueden encontrar en nuestra naturaleza el papel Protocolos n º 1, y en el suplemento de este video. </li><li> Organizar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf en un rack y rellene cada uno con 200 l de la solución de ADN de la sonda. La concentración de la sonda de ADN en esta solución se define la densidad con la que la sonda de ADN de paquete en la superficie del sensor. El rendimiento del sensor es fuertemente dependiente de la densidad de la sonda, con la densidad óptima que van desde la arquitectura del sensor a la siguiente. La concentración de sonda utilizada en este paso lo que debe ser optimizado para cada nuevo tipo de sensor 2. Para las arquitecturas de la sonda se ha investigado hasta la fecha, las concentraciones de ADN de la sonda que empleamos en este rango de paso de 15 nm a 2 micras, con 200 nM de ser un valor típico. </li><li> Enjuague los electrodos de disco de oro con DI-agua, y luego sumergirlas en la solución de sondas de ADN correspondientes en un tubo Eppendorf durante una hora. En este punto, la sonda de ADN se unen a la superficie del electrodo de oro a través de la formación de una monocapa de auto-tiol en oro montado. </li><li> Enjuague los electrodos con agua DI-, lavarlos en 2 mM mercaptohexanol en un tubo Eppendorf y guárdelas en un lugar oscuro durante 3 horas a la noche a temperatura ambiente para asegurar la formación completa de la monocapa de auto-ensambladas. Este paso incluye la mercaptohexanol como parte de una monocapa mixta para garantizar la formación de una monocapa estable. Para evitar la evaporación es posible que desee para sellar el electrodo en el tubo Eppendorf con parafilm. Los sensores pueden ser almacenados en esta solución durante varios días si es necesario. </li><li> Cuando esté listo para usar el sensor, se enjuaga con agua DI-y luego en remojo en una solución tampón por lo menos durante diez minutos. Sensores destinados a la detección de anticuerpos también debe ser sumergido en una solución de 100 nm de la cadena el reconocimiento correspondiente antes de su uso, seguido de un extremadamente rápido enjuague con tampón. </li></ol> 3. Prueba de sensor, detección de ADN <ol><li> En este protocolo, una cadena de 17 nucleótidos de la sonda es colocada en un electrodo de oro. Cuenta con un reportero de azul de metileno redox en su extremo 3 &#39;(figura 1). Cuando la molécula sonda se hibrida con una cadena de captura, la corriente a través del circuito del sensor disminuye. </li><li> Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en un espacio en blancomuestra que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Coloque un electrodo contador de platino y un electrodo de plata / cloruro de plata en la solución de referencia. </li><li> Ejecutar una medida de la onda cuadrada 0 a -0,6 V con una amplitud de 25 mV y un tamaño de paso de 1 mV. La frecuencia óptima de onda cuadrada dependerá de los detalles de la arquitectura de la sonda 2,3, para las arquitecturas de la sonda que han empleado los valores óptimos están típicamente en el rango de 60 a 600 Hz. Usted debe ver un pico redondeado en aproximadamente -0,35 V, el potencial redox de azul de metileno (el máximo potencial puede variar ligeramente en función del pH exacto de su solución de prueba). La altura desde la base de referencia actual para este pico es proporcional a la eficiencia de la transferencia de electrones entre el azul de metileno y el electrodo de oro (Figura 2). Guardar esta medida de fondo. </li><li> Mover los electrodos en una solución que contiene la molécula de ADN de interés objetivo, equilibrar (5 a 120 minutos dependiendo del tamaño, estructura y concentración de la target4, 5) y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar a partir de la medición del fondo inicial,. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de la sustancia analizada. Se trata de los datos de salida principal de este sensor (Figura 3). </li><li> La medición del cambio de la señal relativa, el porcentaje de disminución o aumento de la señal en relación con el pico de fondo, es a menudo más reproducible que la medición del cambio absoluto en la actual, ya que corrige las variaciones en la superficie del electrodo. Para ello, la diferencia entre la corriente de pico y el pico de corriente de fondo están divididos por el pico de fondo actual. </li></ol> 4. Sensor de la regeneración <ol><li> Una vez que sus mediciones se completa, mueva el sensor en un recipiente lleno de agua para la DI-30 s, o de chorro con un flujo constante de agua para la DI-30 s. Repita esto dos veces más con agua desionizada fresca. Nota: algunos analitos son resistentes a este enfoque, para ellos tratar de aclarar agresiva en 6 millones de clorhidrato de guanidina o etanol al 70%. </li><li> Coloque el sensor de nuevo en una solución donde las mediciones se realizarán. En un minuto, la altura del pico debería haber vuelto a su valor original. Vale la pena señalar que estos sensores a menudo muestran un cambio de señal un poco más grande en su primera prueba y el ciclo de regeneración, y los resultados muy consistentes durante los ciclos posteriores 6. </li></ol> 5. Prueba de sensor, la detección de anticuerpos <ol><li> En este protocolo, la sonda de ADN con azul de metileno y tiol modificados utilizados en estos sensores sirve como un &quot;ancla&quot; cadena 7. Que se conecta directamente al electrodo de oro. Esta es entonces hibridado con una segunda, cadena de &quot;reconocimiento&quot; de ADN que se ha conjugado covalentemente al antígeno correspondiente (Figura 4). Hemos tenido buena suerte con la síntesis de las casas comerciales, tales como las tecnologías y Biosearch Panagene, para la síntesis del ADN de antígeno necesaria quimeras. La etapa de la hibridación se lleva a cabo mediante la transferencia de un sensor de pre-fabricados en un tubo Eppendorf que contiene 100 nM de la cadena de reconocimiento del ADN correspondiente en PBS durante 1 hora. </li><li> Coloque el sensor en la solución en blanco correspondiente. Adjuntar a la cabeza del electrodo de trabajo de un potenciostato y un lugar contraelectrodo de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia en la solución. </li><li> Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia de onda cuadrada óptima es de 60 Hz. Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo. </li><li> La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, incubar por 5 a 60 minutos, y recoger una voltammagram segunda onda cuadrada. Si el anticuerpo está presente meta el pico a -0.35 V se reducirá. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de anticuerpos. </li></ol> 6. Prueba de sensor, la detección de moléculas pequeñas <ol><li> En este caso, la molécula de la sonda sobre la superficie del sensor es un aptámero, una molécula de ADN o ARN que ha sido seleccionado in vitro para enlazar un analito específico molecular, que los cambios en su estructura (pliegues) en unión a su analito 8,9 ( Figura 5). Aquí contamos con un enlace de cocaína, aptámero de ADN desarrollada por el laboratorio de 10,11 Stojanovic. </li><li> Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en una muestra en blanco que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Colocar un contador de platino y una referencia de plata / cloruro de plata en la solución. </li><li> Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia óptima de onda cuadrada es de 200Hz (Sin embargo, 60 Hz también funciona). Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo. </li><li> La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, se incuba durante ~ 5 min, y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración del analito. Si usted no puede obtener una muestra de la cocaína, procaína, cuyo uso no está regulada, puede ser utilizado como un sustituto. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Cuando se utiliza para detectar el ADN utilizando la arquitectura en primer lugar, la señal debe disminuir al menos un 60% cuando se equilibra a meta 200 nm. Después de tres lavados brevemente en agua destilada, la señal debe volver muy cerca (a menos de 0,1-5%) a su valor original. Sensores de detección de anticuerpos deben ser sometidos a una disminución de la señal de 40 a 80%. Aptámero basada en sensores para la detección de cocaína muestran un aumento de la señal de hasta un 200% dependiendo de la cobertura de la frecuencia y la superficie a la que trabajan. Para el sensor de cocaína, una baja cobertura de la superficie es el mejor 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Detección de ADN con un biosensor de ADN electroquímico. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Captura de pantalla que muestra la señal producida por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Captura de pantalla que muestra las señales producidas por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada, antes y después de la hibridación con un analito. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Detección de anticuerpos con un biosensor de andamios. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Detección de la cocaína o la procaína con un biosensor electroquímico aptamer. <table border="1"><tbody><tr><td> Costumbre Oligo </td><td> Secuencia </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sonda lineal de ADN (LP17) </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 &#39; </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr><tr><td> ADN diana analito </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Sin modificar </td></tr><tr><td> Reconocimiento Strand </td><td> 5&#39;-antígeno-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> Andamio de anclaje </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr><tr><td> A4 cocaína aptámero </td><td> 5&#39;-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 &#39; </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Sonda y secuencias de ADN diana.

<ol>
	<li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+electrode-immobilized,+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing.">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li><li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor.">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li><li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry.">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li><li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Probe+Length,+Probe+Geometry,+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor.">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li><li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-Based+Electrochemical+Biosensors:+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures.">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li><li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-Specific,+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood,+Soil,+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless,+Reusable+E-DNA+Sensor.">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li><li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein?Small+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices.">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li><li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electronic,+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid,+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids.">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li><li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum.">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li><li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine.">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li><li>Stojanovic, M. N., Prada, P. d. e., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine.">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li><li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Reusable,+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum.">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe.">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li><li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Specificity,+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices.">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li><li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices.">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li><li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless,+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA.">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li><li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor.">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li><li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous,+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic,+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor.">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li></ol>

Una nota importante es que ninguno de los experimentos descritos anteriormente funcionará correctamente a menos que los electrodos se han limpiado adecuadamente. Aquí está una guía a nuestro procedimiento de limpieza electroquímica. Cuando se trabaja con CH potenciostatos Instruments, que ejecutar estos pasos de limpieza con un conjunto de tres programas de macro. Fase Cero (E-limpia O) Sumergir los electrodos en 0.5MH 2 SO 4 y su conexión a los electrodos de trabajo de un potenciostato. También adjunte y sumergirse en una referencia Ag / AgCl y electrodo auxiliar de platino. Comienza con una etapa de oxidación (2 V por 5 s) y luego una etapa de reducción (0,35 V durante 10 s). Phase One (E-limpia 1) Iniciar la oxidación y la reducción de las exploraciones en las mismas condiciones ácidas (0.5MH 2 SO 4) 0,35 a 1,5 V (20 escanea a una velocidad de barrido de 4 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V, seguido de cuatro escanea a una velocidad de barrido de 0,1 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V). La segunda fase (E-limpia 2) Llevar a cabo otra serie de oxidación electroquímica y la reducción de las exploraciones en condiciones de acidez (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4), que abarca cuatro gamas diferentes potenciales (todos ellos realizados por 10 segmentos en una velocidad de barrido de 0,1 V s 1 y un intervalo de muestreo de 0,01 V ): (i) alcance potencial de 0,2 a 0,75 V, (ii) el rango potencial 0,2 a 1,0 V, (iii) potencial de rango 0,2 a 1,25 V, (iv) alcance potencial de 0,2 a 1,5 V. Muchos tipos de electrodos de oro se pueden utilizar para llevar a cabo estos experimentos. Además de los electrodos de disco de oro, como los que trabajan aquí, hemos tenido éxito con las superficies de oro microfabricated, hilo de oro, y oro en los tableros de circuitos impresos. Junto con los sensores descritos en este documento, muchas otras arquitecturas biosensor electroquímico de ADN han sido reportados. Esto incluye los sensores con una pseudoknot 12, capítulo 13 triples, 14 bocadillo, sandwich Super 15, o la arquitectura de triple 16. En el futuro, esperamos que estos sensores se utilizan en el punto de atención de diagnóstico médico. Se han integrado con éxito en varios dispositivos de microfluídica 17,18, y ofrecen muchas ventajas sobre los sistemas ópticos de detección de analitos. En particular, estos sensores pueden funcionar en turbio, ópticamente denso y altamente muestras auto-fluorescentes.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Los electrodos de oro en disco </td><td> CH Instrumentos </td><td> CHI101 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Sonda de ADN sintético </td><td> Biosearch Tecnologías </td><td> Costumbre </td><td></td></tr><tr><td> ADN sintético blanco </td><td> Sigma Genosys </td><td> Costumbre </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> Almacenar en lugar fresco y oscuro </td></tr><tr><td> Electrodo de platino </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Ag / AgCl de referencia </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Paño de limpieza </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Alúmina polaco </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato buffer salino, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instrumentos 605A </td><td> CH Instrumentos </td><td> 605A </td><td> Utilice cualquier potenciostato </td></tr><tr><td> Suero de ternera recién nacido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Almacenan congelados </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Utilice cualquier UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Almacenan congelados </td></tr><tr><td> Cocaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA requiere licencia </td></tr><tr><td> Procaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Sustituto de la cocaína </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-Flag </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules

Como se practica actualmente la medicina, los médicos enviar las muestras a un laboratorio central de pruebas y por lo tanto hay que esperar horas o días para recibir los resultados. Muchos de los pacientes estarían mejor atendidos por las pruebas rápidas de cabecera. Para ello nuestro laboratorio y otros han desarrollado una plataforma versátil, reagentless biosensor que apoya la cuantitativa, la detección reagentless, electroquímica de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), las proteínas (anticuerpos) y analitos pequeñas moléculas sin procesar directamente en muestras clínicas y ambientales. En este video, se demuestra la preparación y utilización de biosensores varios en este &quot;E-DNA&quot; de clase. En particular, fabricamos y demostrar sensores para la detección de una secuencia de ADN diana en una mezcla de reacción de polimerasa en cadena, un anticuerpo específicos para el VIH y la cocaína las drogas. El procedimiento de preparación sólo requiere de tres horas de práctica en el esfuerzo seguido de una incubación durante la noche, y su uso requiere sólo unos minutos.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules at JoVE.com

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

&quot;ADN electrónico&quot; sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Investigación

Bioingeniería

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

Diseño y fabricación de una Unidad de elastómero de suaves modulares Robots en Cirugía Mínimamente Invasiva

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...