Wij danken de Wistar Institute Animal Facility, Microscopie Facility, Histotechnology Facility en Research Supply Center. Dit onderzoek werd deels gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health CA 076674, CA 098101, 025874 en CA CA 10815.

1. De driedimensionale menselijke huid reconstrueren Model: <ol><li> Voorbereiding van de acellulaire laag: Meng de volgende reagentia in een 50 ml buis op ijs: 0,59 ml 10x EMEM, 50 ul 200mm L-glutamine, 0,6 ml FBS, 120 pl 7,5% Natriumbicarbonaat en 4,6 ml bovine collageen I. Voeg 1 mL het mengsel in elke insert van weefselkweek trays. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en laat de gel te stollen. Kleur van het mengsel moet worden van stro-geel tot roze. </li><li> Trypsinize menselijke fibroblasten van cultuur flessen met 0,25% trypsine / EDTA, voeg DMEM met 10% FBS te neutraliseren. Verzamel cellen door centrifugeren en resuspendeer 0,45 x 10 6 cellen in 1,5 ml DMEM met 10% FBS. Voor de dermale stamcellen, het verzamelen van 6600 dermale bollen (wanneer dermale stamcellen groeien in stamcellen medium, vormen ze bolletjes op een vergelijkbare manier met neurospheres) door te tikken op fles naar de sferen, centrifugeren los te maken. </li><li> Voorbereiding van de cellaag: Meng de volgende in een 50 ml buis op ijs: 1,65 ml 10x EMEM, 150 pi 200 mM L-glutamine, 1,85 ml FBS, 350 ul 7,5% Natriumbicarbonaat, 14 ml bovine collageen I en 1,5 mL fibroblasten schorsing uit stap 2 (alternatief, een combinatie van 0,45 x 10 6 fibroblasten en 6600 dermale sferen te gebruiken in 1,5 ml van de huid te reconstrueren medium I voor de huid stamcellen reconstrueert), goed mengen. Voeg 3 ml van het mengsel aan elke acellulaire laag-coating te voegen. Incubeer 45 min bij 37 ° C in een 5% CO 2 weefselkweek incubator. Kleur van het mengsel moet worden van stro geel naar roze. Na de gel stolt, voeg DMEM met 10% FBS (2 ml binnen en 10 ml buiten het invoegen in elke well van de huid te reconstrueren trays). Incubeer voor 4 dagen en zorg ervoor dat de gel contracten. </li><li> Aspireren medium van zowel binnen als buiten elke insert. Voeg wassen medium (HBSS met 1% gedialyseerd FBS) 2 ml aan de binnenkant en 10 ml aan de buitenkant van de plaatsen om te wassen regelmatig serum. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> De voorbereiding van de huid te reconstrueren medium: <ol><li> Voor normale melanocyt en dermale stamcel reconstrueert: Om basisch milieu (500 ml), meng de volgende reagentia: 490 ml keratinocyte serum-vrij medium, 1,8 ml runder hypofyse-extract, 10 ml gedialyseerd foetaal runderserum, 500 pl van 10 ug / mL SCF, 562,5 ul van 4 ug / ml bFGF en 500 ul van 264 ug / ml ET-3. Medium I: Voeg 10 pl EGF van 100 ug / ml tot 100 ml elementaire medium. Medium II: Voeg 2 pl EGF tot 100 ml elementaire medium. Medium III: Voeg 720 ul CaCl 2 van 1 M tot 300 ml elementaire medium. </li><li> Voor melanoom huid te reconstrueren: Om Medium I (100ml), de volgende reagentia mix: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM&#39;s), 2 ml L-glutamine van 200 mm, 200 ul hydrocortison van 269 g / mL, 200 ul VV-regeling van de 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine van 0,05 M, 200 ul adenine van 90 mm, 200 ul Progesteron van 2 nm, 240 pl CaCl 2 van 1 m, 200 pl Triiodothyronine van 10 Nm en 100 ul van chelexed pasgeboren kalf serum (ontbinden 3 g Chelex 100 in 100 ml serum, roer 1,5 uur bij 4 ° C, filter steriliseren). Om ervoor te Medium II (100ml), meng de volgende reagentia: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM&#39;s), 2 ml L-glutamine van 200 mm, 200 ul hydrocortison van 269 g / mL, 200 ul VV van 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine van 0,05 M, 200 ul adenine van 90 mm, 200 ul Progesteron van 2 nm, 240 ul van 1 M CaCl2, 200 ul Triiodothyronine van 10 nm en 100 ul pasgeboren kalf serum. Om ervoor te Medium III (300ml), meng de volgende reagentia: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM&#39;s), 6 ml L-glutamine van 200 mm, 600 ul hydrocortison van 269 g / mL, 600 ul VV van 500X , 600 ul O-phosphorylethanolamine van 0,05 M, 600 ul adenine van 90 mm, 600 ul Progesteron van 2 nm, 720 pl CaCl 2 van 1 M, 600 ul Triiodothyronine van 10 Nm en 6 mL pasgeboren kalf serum. </li></ol></li><li> Trypsinize humane keratinocyten van cultuur flessen met 0,05% trypsine / EDTA, trypsine met soja-bonen trypsine-remmer (250 mg / L in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing) te neutraliseren, spin down, resuspendeer een cel pellet op 4,17 x 10 6 cellen / ml in de huid te reconstrueren medium I. </li><li> Trypsinize menselijke melanocyten of melanoom cellen van cultuur flessen met 0,05% trypsine / EDTA, neutraliseren trypsine met soja-bonen trypsine-remmer, spin down, een celpellet op 0,83 resuspendeer x 10 6 cellen / ml in de huid te reconstrueren medium I. </li><li> Verwijder het wassen medium van zowel binnen als buiten elke insert. </li><li> Voeg de huid reconstrueren medium I (1,5 ml aan de binnenkant en 10 ml aan de buitenkant van elke insert). </li><li> Neem 600 pi celsuspensie van keratinocyten en 600 pi celsuspensie van melanocyten of melanoomcellen, meng goed. Verdeel 200 ul gemengde cel suspensie druppelsgewijs aan de binnenkant van elke insert. Voor de dermale stamcellen te reconstrueren, gebruik 100 ul van keratinocyten opschorting slechts. Incubeer gedurende 2 dagen bij 37 ° C. </li><li> Aspireren huid te reconstrueren medium Ivan zowel de binnenkant en de buitenkant van elke insert. Voeg de huid reconstrueren medium II (2 ml aan de binnenkant en 10 ml naar buiten). Incubeer nog 2 dagen bij 37 ° C. </li><li> Aspireren huid te reconstrueren medium II van de binnenkant en de buitenkant van elke insert, voeg 7,5 ml huid medium III reconstrueren om alleen de buitenkant. Vanaf dit punt, het oppervlak van reconstrueert begint wordt blootgesteld aan de lucht. Verandering medium III om de andere dag tot dag 18. </li><li> Oogst huid te reconstrueren op dag 18: <ol><li> Aspireren media van de binnenkant en de buitenkant van inserts. </li><li> Verwijder de inzetstukken uit lade met een pincet. </li><li> Knip de te reconstrueren (inclusief het polycarbonaat filter) door het traceren van een cirkel dicht bij de rand met een scalpel. </li><li> Snijd de wederopbouw en het filter in de helft op een hard oppervlak. </li></ol></li><li> Voor paraffine secties: plaats de helft van de te reconstrueren in een histologie cassette tussen twee zwarte TBS biopsie papieren en genieten van de hele cassette in 10% formaline voor meer dan 4 uur. Plaats vervolgens de cassette in 70% ethanol en op te slaan bij 4 ° C totdat u klaar bent om het te reconstrueren voor paraffine inbedding proces. </li><li> Voor vriescoupes: <ol><li> Leg de andere helft van de te reconstrueren in 50% saccharose bij 4 ° C gedurende 1-2 uur, verander dan de sucrose te 2M en bij 4 ° C op te slaan voor een ander 1-2 uur. </li><li> Verdeel een optimale snijden temperatuur het vriespunt media (LGO) in een wegwerp basis mal, zodat het vult ongeveer 50% van de boot. Vermijd luchtbellen in de LGO. </li><li> Pak de rand van het te reconstrueren met een tang en verwijder de te reconstrueren uit de sucrose. Plaats het op Kimwipes tot de Kimwipes absorberen de sucrose. </li><li> Breng de te reconstrueren in de basis vorm op de top van de LGO, met behulp van pincet en een spatel. Bedek de bovenkant van het te reconstrueren met meer LGO tot de basis vorm is helemaal vol. Zorg ervoor dat je geen luchtbellen hebben in de LGO waardoor het snijden moeilijk. </li><li> Gelijkmatig Plaats het basisstation schimmel op gemalen droog ijs, en laat de LGO volledig bevriezen. </li><li> Wikkel de basis vorm in aluminiumfolie en bij -70 ° C op te slaan totdat u klaar bent om het te snijden met een cryostaat. </li></ol></li><li> Graft een skin te reconstrueren op een muis: <ol><li> Bereid een 50 ml Falcon buis met 5 ml DMEM (voor invriezen en ontdooien de huid van muizen). </li><li> Gebruik een vrouwelijke SCID haarloze outbred muis rond de 6 weken. </li><li> De muis is verdoofd met isofluraan (EZ anesthesie systeem): de eerste verdoving wordt uitgevoerd in de inductie kamer met 4% isofluraan (voor de muis wordt verplaatst naar de chirurgische bed) en onderhouden van anesthesie door middel van een neuskegel adempauze tijdens de procedure (isofluraan: 1,5-2% ). Warmte ondersteuning door een verwarmde pad om onderkoeling en steriele toegediende oogheelkundige smeermiddel te voorkomen oculaire letsel te voorkomen tijdens de anesthesie. </li><li> Doe 600 ml water in een beker en laat op de top van een hete plaat om temperatuur van het water te houden tussen 40 - 60 ° C. </li><li> Reinig de huid van muizen met samengestelde benzoë tinctuur en alcohol prep swabs. </li><li> Markeer een lijn op de top van de muis terug naar dezelfde positie te houden voor het hechten later. </li><li> Snijd een ronde wondbed ongeveer 1,2 cm in diameter op de muis bovenrug met behulp van Iris schaar en pincet. Bedek de wond met een steriel gaasje sponzen. Leg de ronde muis huid in 5 ml DMEM, dan laat in vloeibare stikstof container totdat het helemaal bevroren. Ontdooi de buis in heet water op de top van een hete plaat totdat er ontdooid. Herhaal dit 3 keer. </li><li> Maak de huid te reconstrueren uit de transwell met behulp van chirurgische mes en verwijder het membraan zeer zorgvuldig, overdracht van de huid (epidermis naar boven) te reconstrueren op de top van het wondbed. </li><li> Plaats de muis huid (epidermis naar boven) op de top van de huid te reconstrueren. </li><li> Maak de eerste hechting op de marker eerder gemerkt, de tweede op de bodem, daarna nog twee hechtingen aan de zijkanten van de muis huid op te lossen. </li><li> Reinig de huid van muizen na de transplantatie. Verwijder de neuskegel en houd de muis op het verwarmde pad totdat wakker en ambulante. </li><li> Zet de muis in een nieuwe kooi. </li><li> Post-operatieve analgesie: Meloxicam (1 mg / kg) via subcutane injectie onmiddellijk na de operatie, 24 uur en 48 uur na de operatie. </li></ol></li></ol> 2. Representatieve resultaten: Huid reconstrueert met normale melanocyten en dermale stamcellen De huid reconstrueert worden gekweekt in een speciaal 6-well tray met inserts. De dermale compartiment is gekweekt in DMEM met 10% FBS voor de eerste vier dagen (Fig. 1A). De huid reconstrueren medium I wordt gebruikt wanneer keratinocyten zijn bezaaid met melanocyten of melanoom cellen (Fig. 1B). De epidermis is blootgesteld aan de lucht op dag 9 en dit maakt keratinocyten om onderscheid te maken (Fig. 1C). Op dag 18, de epidermis van de huid reconstrueert is samengesteld uit gelaagd keratinocyten lagen. De ongedifferentieerde basale laag en opeenvolgend gedifferentieerde lagen zijn verticaal georiënteerd (fig. 1D). VlekING het gedeelte van reconstrueert met de melanocytaire marker S100 laat zien dat melanocyten worden uitgelijnd in de basale laag van de opperhuid en te communiceren met meerdere keratinocyten door dendriet extensies (fig. 1E). De dermale compartiment bevat fibroblasten ingebed in een collageen type I matrix. Gedeponeerd collageen IV geeft de basale membraan, die de opperhuid scheidt van de dermis (fig. 1F). Wanneer dermale stamcellen (gelabeld met GFP lentivirale vector) zijn ingebed met fibroblasten in een collageen I matrix, trekken ze naar de epidermis en te differentiëren in melanocyten (1), (afb. 2). Meerdere lagen van keratinocyten in de epidermis worden ontwikkeld. Huid reconstrueert van melanoom tumoren Clinicopathologische studies wijzen uit dat melanomen vooruitgang in een stapsgewijs: gemeenschappelijke verworven naevi, dysplastische nevi, RGP (radiale groeifase) melanomen, VGP (verticale groeifase), melanomen en metastatische melanomen (7). Verschillende stadia van melanoom cellijnen zijn morfologisch op elkaar lijken in 2-D cultuur (Fig. 3A-D), maar wanneer zij worden opgenomen in de huid reconstrueert, het gedrag van de cellen weerspiegelt hun in vivo eigenschappen. De locatie en de groei van normale melanocyten worden streng gecontroleerd in de huid reconstrueert (Afb. 3E). RGP primaire melanomen WM35 prolifereren voornamelijk in de epidermis (fig. 3F), terwijl VGP melanomen WM793 groeien invasief in de dermis (Fig. 3G). Uitgezaaide melanomen 1205Lu agressief diep binnen te dringen in de dermis (Fig. 3H). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> Figuur 1. Huid reconstrueert met normale melanocyten. De bruto uiterlijk van de huid reconstrueert is te zien in AC. A. Fibroblasten gemengd met collageen worden gekweekt in DMEM met 10% FBS en vorm dermale compartiment. B. keratinocyten en melanocyten worden gezaaid op de top van de dermis en groeien in de huid te reconstrueren medium. C. De epidermis wordt blootgesteld aan de lucht op dag 9. D. H &amp; E-gekleurde huid te reconstrueren presenteert de opperhuid bestaat uit verticaal, gericht op basale laag, en achtereenvolgens gedifferentieerde gestratificeerde cellagen. De dermis bevat fibroblasten ingebed in een collageen type I matrix. E. S100-positieve melanocyten (zwarte pijlen) zijn uitgelijnd op de basaalmembraan en te communiceren met meerdere keratinocyten. F. collageen IV-kleuring geeft aan dat de basale membraan, die de opperhuid scheidt van de dermis. Alle kleuringen in DF werden uitgevoerd op in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde coupes. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> Figuur 2. Dermal stamcellen in de huid reconstrueert migreren naar de epidermis en differentiëren in melanocyten. Op dag 5 na het uitzaaien keratinocyten, single GFP-positieve cellen (groen) start migreren uit van sferen. De epidermis is nog steeds bestaat uit een enkele laag. Op dag 8, een enkele cellen bij de epidermis-dermis interface. Per dag 10, zijn GFP-positieve cellen strak uitgelijnd op de basale membraan positie. De gemigreerde GFP-positieve cellen in de opperhuid uitdrukkelijke melanocytaire marker HMB45 (rood, zoals aangegeven door witte pijlen). Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). De epidermis is ontwikkeld als meerdere lagen. De kelder membraan wordt aangegeven met witte stippellijnen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> Figuur 3. Huid reconstrueert van de verschillende stadia van melanomen: AD. Normale melanocyten en melanoom cellen gekweekt in 2D culturen. A. Melanocyten van de voorhuid. B. RGP WM35 cellen. C. VGP WM793 cellen. D. uitgezaaide melanomen 1205Lu cellen. E. Normale melanocyten bevinden zich op de basale membraan. F. RGP melanoom WM35 cellen groeien als cel clusters in de opperhuid. G. VGP melanoom WM793 cellen binnen te dringen in de dermis door basaal membraan. H. uitgezaaide melanoom 1205Lu cellen binnen te dringen agressief diep in dermis. Het oplossen van problemen <table border="1"><tbody><tr><td> Probleem </td><td> Het oplossen van problemen </td></tr><tr><td> Collageen mengsel niet stollen </td><td> Collageen mengsel kleur moet worden stro-geel naar roze, anders pH-waarde is verkeerd en collageen kan niet gel. Als de kleur is helder geel, moet meer natriumbicarbonaat worden toegevoegd druppelsgewijs. </td></tr><tr><td> Collageen precipitaten voortijdig in de mixuture </td><td> Houd alle componenten op ijs totdat het collageen mengsel wordt geplaatst op de plaats </td></tr><tr><td> Gecontracteerd collageen is niet eens (de ene kant is dikker dan de andere kant) </td><td> Kalibreer de plank van de incubator </td></tr><tr><td> De opperhuid wordt gevormd met minder dan drie lagen keratinocyten. </td><td> Gebruik ongedifferentieerde keratinocyten bij lagere passages </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben beschreven het genereren van 3D-skin reconstrueert met normale menselijke melanocyten, dermale stamcellen en melanoom cellen. Wanneer ze groeien in monolaag cultuur, melanocytaire cellen die aanwezig zijn een vergelijkbare morfologie (afgeplat, spindel of meer dendritische-vormig), ongeacht hun herkomst van de klinische fase. In contrast, 3D-skin reconstrueert recapituleren stadium-specifieke eigenschappen van melanoom cellen. Normale menselijke melanocyten verblijf te houden in de kelder membranen tussen de epidermale en de dermale lagen als afzonderlijke cellen. RGP primaire melanoom cellen groeien als kleine clusters langs de basaalmembraan terwijl meer agressieve VGP melanoom cellen groeien zo groot clusters doorbreken van het basaal membraan in de dermis. Uitgezaaide melanoom cellen groeien in alle richtingen en binnen te dringen diep in de dermis als enkele cellen of clusters. Kwantitatieve analyses kunnen worden uitgevoerd op dit model door het meten van de diepte van invasie en de mate van proliferatie. Naast de karakterisering van normale en maligne melanocytaire cellen, met behulp van het model dat we kunnen direct leiden tot de differentiatie van stamcellen in de huid gerijpt melanocyten, die de thuisbasis van de basale laag van de opperhuid en de bonafide communicatie met keratinocyten tot stand door de opregulatie van E-cadherine ( 6). Met behulp van virale vectoren, zijn we in staat om ofwel te activeren of functie van een gen te inactiveren voor een beter begrip van de dynamiek en de functionele betekenis van genen die tot expressie door elk celtype in de huid reconstrueert, die belooft te worden een efficiënt model om niet alleen de transformatie mechanismen van melanocyten studie , maar ook de progressie van melanoom (8). Waarneming op lange termijn van de cel fenotypes is mogelijk geworden door de enten van de huid reconstrueert aan immunodeficiënte dieren. Zo&#39;n menselijke huid-mouse chimera is een excellent onderzoek hulpmiddel om melanomagenesis en melanoom metastase te bestuderen. Skin reconstrueert kan ook een nuttig platform voor drugs beoordeling. Veel geneesmiddelen die kankercellen uit te roeien in 2D kweekomstandigheden hebben vaak weinig effect in de experimentele en klinische toepassingen. Zoals te zien in de in vivo tumor, melanoom cellen in 3D culturen zijn vaak resistent tegen de geneesmiddelen die cellen in 2D culturen reageren, wat suggereert dat de micro-omgeving signaalwegen moduleert in melanoom. Voor een succesvolle drug discovery, de 3D-huid te reconstrueren model is een ideaal instrument om de preklinische effecten van stoffen in vivo (9,10) te voorspellen. Samengevat, de huid te reconstrueren modellen overbruggen van de kloof tussen de in vitro en in vivo studies. Ze zullen leiden tot een beter begrip van welke genen betrokken zijn bij de transformatie en de manier waarop stamcellen bijdragen aan die transformatie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> 10x EMEM </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.071,02 </td></tr><tr><td> Bovine Pees zuurgeëxtraheerde Collageen </td><td> Organogenese </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Tissue Culture 6-well laden met Inserts </td><td> Organogenese </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Keratinocyten serumvrij medium </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Gedialyseerd Fetal Calf Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.079,03 </td></tr><tr><td> recombinant humane stamcellen Factor </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> Basic FGF </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> Endotheline-3, de menselijke </td><td> Amerikaanse Peptide Co </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH Biosciences </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM&#39;s) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> Insuline, transferrine, Ethanolamine, Selenium (VV) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adenine </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triiodothyronine </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> Pasgeboren kalf serum </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10% buffer formaline </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Optimale snijden temperatuur het vriespunt media (LGO) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Multi cassettes </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> TBS biopsie papers </td><td> Triangle Biomedische Wetenschappen </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS biopsie papers </td><td> Triangle Biomedische Wetenschappen </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Wegwerp Base Matrijzen </td><td> Visser </td><td> 15 tot 182-501C </td></tr><tr><td> Compound benzoin tinctuur </td><td> Professionele Disposables, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> Alcohol Prep Swabs </td><td> CVS apotheek </td><td></td></tr><tr><td> Silk Black Gevlochten 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Gaas sponzen (steriele) </td><td> CVS apotheek </td><td></td></tr><tr><td> Pincet </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> Iris schaar </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Chirurgische messen </td><td> Veer </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ anesthesie </td><td> Euthanex Corp </td><td></td></tr><tr><td> SCID haarloze outbred muis </td><td> Charles River </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

De meeste in-vitro studies in experimentele huid biologie hebben gedaan in twee-dimensionale (2D) monoculturen, terwijl het vergaren van bewijs suggereert dat cellen zich anders gedragen wanneer ze worden gekweekt in een 3D-extra-cellulaire matrix en ook interactie met andere cellen (1-5) . Muismodellen zijn in grote lijnen gebruikt om weefsel morfogenese in vivo studie. Maar muis en de menselijke huid hebben significante verschillen in cellulaire architectuur en fysiologie, waardoor het moeilijk is om de muis studies te extrapoleren naar mensen. Aangezien de melanocyten in de huid van muizen zijn meestal gelokaliseerd in haarzakjes, ze hebben verschillende biologische eigenschappen van die van de mens, die vooral op te zoeken op de basale laag van de opperhuid. De recente ontwikkeling van 3D-menselijke huid te reconstrueren modellen heeft het gebied tot cel-matrix en cel-cel interacties tussen verschillende celtypen te onderzoeken ingeschakeld. Het reconstrueert bestaan ​​uit een &quot;dermis&quot; met fibroblasten ingebed in een matrix van collageen I, een &quot;epidermis&quot;, die bestaat uit gelaagd, gedifferentieerde keratinocyten en een functionele basale membraan, die opperhuid scheidt van dermis. Collageen zorgt steigers, voedingsstoffen, en de mogelijkheden voor cel-cel interactie. De 3D-skin modellen die melanocytaire cellen recapituleren natuurlijke kenmerken van melanocyten homeostase en melanoomprogressie in de menselijke huid. Net als in vivo, worden melanocyten in gereconstrueerde huid gelokaliseerd in de basale membraan afgewisseld met basale laag keratinocyten. Melanoom cellen vertonen dezelfde kenmerken als gevolg van de oorspronkelijke tumor stadium (RGP, VGP en gemetastaseerd melanoom cellen) in vivo. Onlangs hebben dermale stamcellen zijn geïdentificeerd in het humane dermis (6). Deze multi-potente stamcellen kunnen migreren naar de opperhuid en differentiëren naar melanocyten.

Watch this Scientific Journal Video about The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression at JoVE.com

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

In dit rapport beschrijven we de drie-dimensionale huid te reconstrueren model dat de menselijke huid nabootst in de architectuur en compositie. Melanocyt fysiologie, melanoomprogressie en het lot van dermale stamcellen zijn onderzocht met behulp van de huid te reconstrueren model. Het model is ook bruikbaar als een preklinische hulpmiddel voor drugs beoordeling.

De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Vlakke en Three-Dimensional Printing van geleidende inkten

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Huid tatoeëren als een nieuwe benadering voor DNA-vaccin Levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Een verbeterde werkwijze voor de bereiding van type I collageen van de huid

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Onderzoek naar de driedimensionale stroomscheiding geïnduceerd door een model vocal fold poliep

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...