Name: agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton at JoVE.com

We zijn dankbaar voor Drs. SP-Dinesh Kumar en Yule Liu voor TRV-VIGS vectoren, en Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr en Bayer CropScience voor het leveren van katoenzaad. Dit werk werd gefinancierd door NSF te LS en NIH naar PH

1. Grow katoen zaailingen <ol><li> Zaai de zaden van de hoger gelegen katoen (Gossypium hirsutum) variëteit Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR en Deltapine 90 in pot (7 cm in diameter) met Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Bewaar de potten in een bak bedekt met een plastic koepel bij 23 ° C, 120 μE m -2 s -1 licht, met een 12 uur light/12 uur donker fotoperiode in een groei kamer. </li><li> Verwijder de koepel als twee zaadlobben naar voren zijn gekomen. </li><li> Ongeveer twee weke...

<ol>
	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

VIGS is bewezen een krachtig instrument in functional genomics analyse worden door tijdelijk kloppen beneden de expressie van endogene genen. In deze studie hebben we een Agrobacterium-gemedieerde VIGS ontwikkeld door gebruik te maken van een TRV-op basis van binaire vector. De katoenen CLA1 (GrCLA1) gen werd ontwikkeld als een visuele marker om het zwijgen efficiëntie te monitoren. We hebben consequent verkregen 100% van gene silencing efficiëntie, blijkt uit het albino fenotype die op de echte bladeren in a...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van de reagentia en apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus / serienummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Roller drum </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bacterie cultuur </td></tr><tr><td> Couveuse </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bacterie cultuur </td></tr><tr><td> UV / Vis spectrofotometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: DU530 </td><td> Het meten van OD </td></tr><tr><td> Gene Puiser </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652076; Serial: 154BR3880 </td><td> Elektroporatie </td></tr><tr><td> Pulser Controller </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652098; Serial: 232BR4833 </td><td> Elektroporatie </td></tr><tr><td> Micropulser Elektroporatie kuvet </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Elektroporatie </td></tr><tr><td> 1 ml spuit </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Enten van agro-bacterie </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Groeiende zaailing </td></tr><tr><td> Terra Cotta pot </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Groeiende zaailing </td></tr><tr><td> MES monohydraat </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Infiltratie buffer </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Infiltratie buffer </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

Katoen (Gossypium hirsutum) is een van de belangrijkste gewassen ter wereld. Aanzienlijke inspanningen geleverd op moleculaire veredeling van nieuwe rassen. De grootschalige gen functionele analyse in katoen is achtergebleven bij de meeste van de moderne plantensoorten, waarschijnlijk vanwege de grote omvang van het genoom, gen duplicatie en polyploïdie, lange groeicyclus en weerspannigheid aan genetische transformatie 1. Ter bevordering van high-throughput functionele genetische / genomische studie in katoen, proberen we een snelle en efficiënte voorbijgaande assays te ontwikkelen om katoen genfuncties te beoordelen. Virus-Induced gen silencing (VIGS) is een krachtige techniek die werd ontwikkeld op basis van de host Post-transcriptionele gene silencing (PTGS) van virale proliferatie 2,3 onderdrukken. Agrobacterium-gemedieerde VIGS is met succes toegepast in een breed scala van tweezaadlobbigen soorten zoals Solanaceae, Arabidopsis en peulvruchten soorten, en eenzaadlobbigen soorten, waaronder gerst, tarwe en maïs, voor de verschillende functionele genomische studies 3,4. Aangezien dit een snelle en efficiënte aanpak voorkomt plant transformatie en overwint functionele redundantie, is het bijzonder aantrekkelijk en geschikt voor functionele genomische studie bij de teelt van soorten, zoals katoen niet vatbaar voor transformatie. In deze studie hebben we het verslag van de gedetailleerd protocol van Agrobacterium-gemedieerde VIGS systeem in katoen. Onder de verschillende virale vectoren VIGS, de tabak rammelaar virus (TRV) binnenvalt een breed scala van hosts en is in staat om krachtig verspreid over de gehele plant nog te produceren milde symptomen op de hosts5. Om het zwijgen op te leggen efficiëntie, GrCLA1, een homoloog gen van Arabidopsis Cloroplastos alterados een gen (AtCLA1) in katoen, is gekloond en ingevoegd in de VIGS binaire vector pYL156. CLA1 gen is betrokken bij de ontwikkeling chloroplast 6, en eerdere studies hebben aangetoond dat de te controleren verlies-van-functie van de AtCLA1 resulteerde in een albino fenotype op echte bladeren 7, biedt een uitstekende visuele marker voor zwijgen efficiency. Op ongeveer twee weken na Agrobacterium infiltratie, de albino fenotype begonnen te verschijnen op de echte bladeren, met 100% silencing-efficiëntie in alle gerepliceerde experimenten. Het zwijgen van endogene genexpressie werd ook bevestigd door de RT-PCR-analyse. Aanzienlijk, kon zwijgen krachtig optreden in alle cultivars die we hebben getest, waaronder verschillende commercieel geteelde rassen in Texas. Deze snelle en efficiënte Agrobacterium-gemedieerde VIGS test levert een zeer krachtige tool voor het snel op grote schaal analyse van gen-functies op genoom-brede niveau in katoen.

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

We presenteren de gedetailleerde protocol voor Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) test in katoen. De tabak rammelaar virus (TRV)-afgeleide VIGS vectoren werden ingezet om RNA-silencing van katoen GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gen induceren. De albino fenotype veroorzaakt door zwijgen op te leggen GrCLA1 ​​werd waargenomen bij de zaailing fase binnen 2 weken na inoculatie.

Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Gemedeerde onrijpe embryotransformatie van recalcitrante maïsinteeltlijnen met behulp van morfogene genen

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Gemedieerde genetische transformatie, transgene productie, en de toepassing ervan voor de studie van mannelijke reproductieve ontwikkeling in rijst

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...