Name: agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00
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Wir sind dankbar, dass Drs. SP Dinesh Kumar-und Yule Liu für TRV-VIGS Vektoren und Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr und Bayer CropScience für die Bereitstellung von Baumwollsamen. Diese Arbeit wurde von der NSF, um LS und NIH zur PH finanziert

1. Wachsen Baumwolle Sämlinge <ol><li> Aussaat der Samen der Upland-Baumwolle (Gossypium hirsutum) Reihe Fibermax 832, PhytoGen 425RF, PhytoGen 480WR und Deltapine 90 in Töpfen (7 cm Durchmesser) mit Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Halten Sie die Töpfe in ein Tablett mit einer Plastikhaube abgedeckt bei 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 Licht, mit einer 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkelheit Photoperiode in einem Wachstumsmarkt Raum. </li><li> Entfernen Sie die Kuppel, wenn zwei Keimblätter entsta...

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	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

VIGS ist nachgewiesen worden, ein mächtiges Werkzeug in der funktionellen Genomanalyse werden durch transiente umzuwerfen der Expression endogener Gene. In dieser Studie entwickelten wir eine Agrobacterium-vermittelte VIGS durch die Verwendung eines TRV-basierten binären Vektor. Die Baumwolle Cla1 (GrCLA1)-Gen wurde als visuelle Marker entwickelt, um die Wirksamkeit beim Verstummen zu überwachen. Wir haben immer 100% der Gen-Silencing Effizienz, durch die Albino-Phänotyp, die auf der echten Blätter in alle...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name der Reagenzien und Geräte </th><th> Firma </th><th> Katalog / Seriennummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Roller Trommel </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-Bakterium Kultur </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-Bakterium Kultur </td></tr><tr><td> UV / Vis-Spektralphotometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: DU530 </td><td> Mess-OD </td></tr><tr><td> Gene Pulser </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652076; Serial: 154BR3880 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> Pulser-Controller </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652098; Serial: 232BR4833 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> Micropulser Elektroporationsküvette </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> 1 ml Spritze </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Inokulation von agro-Bakterium </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Wachsende Sämling </td></tr><tr><td> Terra Cotta Topf </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Wachsende Sämling </td></tr><tr><td> MES-Monohydrat </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Infiltration Puffer </td></tr><tr><td> Acetosyringon </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Infiltration Puffer </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

Baumwolle (Gossypium hirsutum) ist eine der wichtigsten Kulturpflanzen weltweit. Erhebliche Anstrengungen wurden auf molekularer Züchtung neuer Sorten gemacht worden. Die groß angelegte Gen funktionelle Analyse in Baumwolle hat hinter den meisten der modernen Pflanzenarten, wahrscheinlich aufgrund seiner Größe von Genom, Gen-Duplikation und Polyploidie, lange Wachstumszyklus und Widerspenstigkeit zu genetischen Transformation 1 wurde zurückgeblieben. Zur Erleichterung der hohen Durchsatz funktionelle genetische / genomische Studie in Baumwolle, versuchen wir eine schnelle und effiziente transienten Assays zu entwickeln, um Baumwolle Genfunktionen zu beurteilen. Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) ist eine mächtige Technik, basierend auf dem Host-post-transkriptionelle Gene Silencing (PTGS), um die Vermehrung der Viren 2,3 unterdrücken entwickelt wurde. Agrobacterium-vermittelte VIGS wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Dikotyledonen Arten wie Solanaceae, Arabidopsis und Leguminosen angewandt und Monokotyledonen Arten, darunter Gerste, Weizen und Mais, die aus verschiedenen funktionellen Genomik Studien 3,4. Da dies eine schnelle und effiziente Ansatz vermeidet Transformation von Pflanzen und überwindet funktionale Redundanz ist es besonders attraktiv und geeignet für funktionelle Genomik Studie in Nutzpflanzen wie Baumwolle nicht zugänglich für die Transformation. In dieser Studie berichten wir über die detaillierte Protokoll der Agrobacterium-vermittelte VIGS System in Baumwolle. Unter den verschiedenen viralen Vektoren VIGS, dringt der Tabak Rassel-Virus (TRV) eine breite Palette von Hosts und ist in der Lage, kräftig ausgebreitet über den gesamten Anlagen noch produzieren milde Symptome auf der hosts5. Um die Wirksamkeit beim Verstummen, GrCLA1, ein Homologes Gen aus Arabidopsis Cloroplastos alterados 1-Gen (AtCLA1) in Baumwolle, wurde kloniert und in die VIGS Binärvektor pYL156. Cla1 Gen in Chloroplasten Entwicklung 6 beteiligt sind, und frühere Studien haben gezeigt, Monitor, loss-of-Funktion AtCLA1 führte zu einem Albino-Phänotyp auf Laubblätter 7, bietet eine exzellente visuelle Marker für silencing Effizienz. Bei etwa zwei Wochen nach Agrobacterium Infiltration begann die Albino-Phänotyp auf der Laubblätter erscheinen, mit 100% silencing Effizienz in allen wiederholten Experimenten. Das Schweigen der endogenen Genexpression wurde auch durch RT-PCR-Analyse bestätigt. Bezeichnenderweise konnte silencing potently in allen Sorten haben wir getestet, darunter verschiedene kommerziell angebauten Sorten in Texas auftreten. Diese schnelle und effiziente Agrobacterium-vermittelte VIGS Test liefert ein sehr mächtiges Werkzeug für die schnelle großflächige Analyse von Genfunktionen in Genom-weiten Ebene in Baumwolle.

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Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Wir präsentieren Ihnen die ausführlichen Protokoll für Agrobacterium-vermittelten Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Assay in Baumwolle. Der Tabak Rassel-Virus (TRV)-abgeleiteten Vektoren VIGS wurden eingesetzt, um RNA-Silencing von Baumwolle GrCLA1, Cloroplastos alterados 1-Gens zu induzieren. Der Albino-Phänotyp durch Schweigen GrCLA1 ​​verursacht wurde am Keimlingsstadium innerhalb von 2 Wochen nach der Impfung beobachtet.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Forschung

Biologie

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

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Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...