Name: agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton at JoVE.com

Siamo grati a Drs. SP-Dinesh Kumar e Yule Liu per TRV-VIGS vettori, e Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr e Bayer CropScience per la fornitura di semi di cotone. Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF per LS e NIH di PH

1. Crescere piantine di cotone <ol><li> Gettare i semi del cotone di montagna (Gossypium hirsutum) varietà Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR e Deltapine 90 in vasi (7 cm di diametro) contenente Mix Metro 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Conservare i vasi in un vassoio coperto con una cupola di plastica a 23 ° C, 120 μE m -2 s -1 luce, con un fotoperiodo di 12 ore light/12 buia in una stanza di crescita. </li><li> Rimuovere la cupola quando due cotiledoni sono emerse. </li><li> Circa due set...

<ol>
	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

VIGS ha dimostrato di essere un potente strumento di analisi genomica funzionale da transitoriamente abbattendo l&#39;espressione di geni endogeni. In questo studio, abbiamo sviluppato un mediata da Agrobacterium VIGS utilizzando un TRV-vettoriale binario. Il cotone CLA1 (GrCLA1) gene è stato sviluppato come marcatore visivo per monitorare l&#39;efficienza tacere. Abbiamo sempre ottenuto il 100% di efficienza silenziamento genico, dimostrato dal fenotipo albino che appaiono sulle foglie vere in tutte le variet...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome dei reagenti e attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Catalogo / Numero di serie </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Rullo di tamburo </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-batterio della cultura </td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-batterio della cultura </td></tr><tr><td> UV / Vis spettrofotometro </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modello: DU530 </td><td> Delle DO </td></tr><tr><td> Gene Pulser </td><td> BioRad </td><td> Modello: 1652076; di serie: 154BR3880 </td><td> Elettroporazione </td></tr><tr><td> Pulser controller </td><td> BioRad </td><td> Modello: 1652098; di serie: 232BR4833 </td><td> Elettroporazione </td></tr><tr><td> Micropulser Elettroporazione cuvetta </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Elettroporazione </td></tr><tr><td> 1 ml siringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Inoculazione di agro-batterio </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Piantina in crescita </td></tr><tr><td> Terra Cotta pentola </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Piantina in crescita </td></tr><tr><td> MES monoidrato </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Infiltrazione tampone </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Infiltrazione tampone </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

Cotone (Gossypium hirsutum) è una delle colture più importanti del mondo. Notevoli sforzi sono stati fatti sulla riproduzione molecolare di nuove varietà. La grande analisi del gene funzionale in cotone è stato ritardato dietro la maggior parte delle specie vegetali moderna, probabilmente dovuto alle sue grandi dimensioni del genoma, duplicazione genica e poliploidia, ciclo di crescita a lungo e recalcitrante alla trasformazione genetica 1. Per facilitare un elevato throughput studio funzionale genetica / genomica in cotone, cerchiamo di sviluppare analisi transienti rapidi ed efficaci per valutare le funzioni del gene cotone. Virus-Induced silenziamento genico (VIGS) è una tecnica potente che è stato sviluppato in base all&#39;host post-trascrizionale silenziamento genico (PTGS) per reprimere la proliferazione virale 2,3. Mediata da Agrobacterium VIGS è stato applicato con successo in una vasta gamma di specie dicotiledoni come Solanacee, specie Arabidopsis e legumi, e specie tra monocotiledoni orzo, frumento e mais, per vari studi di genomica funzionale 3,4. Dato che questo approccio rapido ed efficiente evita la trasformazione delle piante e supera ridondanza funzionale, è particolarmente interessante e adatto per lo studio genomica funzionale in specie vegetali come il cotone non suscettibili di trasformazione. In questo studio, riportiamo il protocollo dettagliato di Agrobacterium mediata dal sistema VIGS in cotone. Tra i diversi vettori virali VIGS, il virus sonaglio tabacco (TRV) invade una vasta gamma di ospiti ed è in grado di diffondere con forza in tutto l&#39;intero impianto ancora produrre sintomi lievi sul hosts5. Per monitorare l&#39;efficienza di silenziamento, GrCLA1, un gene omologo di Cloroplastos Arabidopsis alterados 1 gene (AtCLA1) in cotone, è stato clonato e inserito nel binario VIGS vettore pYL156. CLA1 gene è coinvolto nello sviluppo cloroplasti 6, e studi precedenti hanno dimostrato che perdita di funzione di AtCLA1 portato ad un fenotipo albino sulle foglie vere 7, fornendo un eccellente marcatore visivo per far tacere l&#39;efficienza. A circa due settimane dopo l&#39;infiltrazione Agrobacterium, il fenotipo albino iniziato a comparire sulle foglie vere, con un&#39;efficienza di silenziamento del 100% in tutti gli esperimenti replicati. Il silenziamento dei geni endogeni è stato confermato anche da analisi RT-PCR. Significativamente, mettendo a tacere potentemente potrebbe verificarsi in tutte le cultivar che abbiamo provato, tra cui diverse varietà coltivate commercialmente in Texas. Questo rapido ed efficiente mediata da Agrobacterium test VIGS fornisce uno strumento molto potente per una rapida analisi su larga scala delle funzioni dei geni a livello di genoma in cotone.

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Vi presentiamo il protocollo dettagliato per Agrobacterium mediata indotta da virus silenziamento genico (VIGS), saggio in cotone. Il virus crepitio del tabacco (TRV)-vettori derivati ​​VIGS sono stati schierati per indurre il silenziamento dell&#39;RNA di cotone GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. Il fenotipo albino causati da tacere GrCLA1 ​​è stata osservata nella fase piantina entro 2 settimane dopo l&#39;inoculazione.

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Ricerca

Biologia

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...