Name: agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00
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我々は、博士に感謝しています。 SPディネッシュ-クマールとユール劉TRV - VIGSのベクトルに対して、と博士。チャックKenerley、テリーウィーラー、ジムスターと綿の種子を提供するためのバイエルクロップサイエンス社。この作品は、PHにLSとNIHにNSFによって資金を供給された

1。綿の苗を育て<ol><li>アップランド綿（チョウ目害虫抵抗性ワタ）、様々なFibermax 832、Phytogen 425RF、Phytogen 480WRおよびメトロミックス700（SunGR、Beavile、ワシントン州）を含むポット（直径7cm）でDeltapine 90の種をまく。 </li><li> 23℃プラスチックドームで覆われているトレイにポットを保つ成長室で12時間light/12時間暗光周期と° C、120μEM -2 S -1の光、。 </li><li> two子葉が浮上して...

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	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

VIGSは、一時的に内在性遺伝子の発現をノックダウンにより、機能的なゲノミクス解析の強力なツールであることが証明されています。本研究では、我々はTRV -ベースのバイナリーベクターを利用することにより、アグロバクテリウムを介したVIGSを開発した。綿CLA1（GrCLA1）遺伝子サイレンシングの効率を監視するための視覚的なマーカーとして開発されました。我々は一貫して取得し?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬と機器の名称</th><th>会社</th><th>カタログ/シリアル番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ローラードラム</td><td>グラス=コル、LLC。 </td><td> 099A TC108 </td><td>アグロバクテリアの培養</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>シェルドンマニュファクチャリング株式会社</td><td> 01046209 </td><td>アグロバクテリアの培養</td></tr><tr><td> UV / VIS分光光度計</td><td>ベックマンコールター</td><td>モデル：DU530 </td><td>測定OD </td></tr><tr><td>ジーンパルサー</td><td> BioRad社</td><td>モデル：1652076;シリアル：154BR3880 </td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>パルサーコントローラ</td><td> BioRad社</td><td>モデル：1652098;シリアル：232BR4833 </td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td> Micropulserエレクトロポレーションキュベット</td><td> BioRad社</td><td> 165-2081 </td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td> 1 mlのシリンジ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 30962 </td><td>アグロバクテリアの接種</td></tr><tr><td>メトロミックス700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU＃553001 </td><td>成長する苗</td></tr><tr><td>テラコッタポット</td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td>成長する苗</td></tr><tr><td> MES一水和物</td><td> USB </td><td> 18886 </td><td>浸潤のバッファ</td></tr><tr><td>アセトシリンゴン</td><td>シグマ</td><td> D134406 </td><td>浸潤のバッファ</td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

コットン（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ） が世界中で最も重要な作物の一つです。かなりの努力が、新品種の分子育種が行われている。綿花の大規模な遺伝子機能解析は、ゲノム、遺伝子重複と倍数性、遺伝的形質転換1〜長期成長サイクルと反抗のその大きさに起因する可能性が高い近代的な植物種、の中で最も遅れをとっている。綿の高スループット機能遺伝学/ゲノム研究を容易にするために、我々は、綿の遺伝子機能を評価するために迅速かつ効率的なトランジェントアッセイの開発を試みる。 ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）は、ウイルス増殖2,3を抑制する宿主転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）に基づいて開発された強力な手法です。 Agrobacterium媒介VIGSが正常に様々な機能ゲノム研究の3,4のために、広くそのようなナス科、シロイヌナズナおよびマメ科植物の種などの双子葉植物の種の範囲、及び大麦、小麦、トウモロコシを含む単子葉植物の種に適用されている。この迅速かつ効率的なアプローチは、植物形質転換を回避し、機能的な冗長性を克服するとして、それは特に魅力的と変換のための従順ではない綿のような作物種の機能性ゲノム研究に適しています。 本研究では、我々は、綿のアグロバクテリウムVIGSのシステムの詳細なプロトコールを報告する。いくつかのウイルスVIGSのベクターのうち、タバコのガラガラのウイルス（TRV）がホストの広い範囲に侵入した後、まだhosts5で軽度の症状を作り出すプラント全体にわたって精力的に感染することが可能です。サイレンシングの効率を監視するには、GrCLA1、綿のシロイヌナズナCloroplastos alterados 1遺伝子（AtCLA1）のホモログ遺伝子が、VIGSのバイナリーベクターpYL156中にクローニングし、挿入されている。CLA1遺伝子が葉緑体の開発6、および以前の研究に関与していることはことが示されているAtCLA1の機能喪失効率を黙らせるための優れた視覚的なマーカーを提供する、真の葉7のアルビノ表現型をもたらした。約2週間でポストアグロバクテリウムの浸潤、アルビノ表現型はすべて反復実験で100％のサイレンシングの効率で、真の葉の上に登場し始めました。内因性遺伝子発現のサイレンシングは、RT - PCR分析により確認した。著しく、サイレンシングが強力にテキサス州の様々な商業的に栽培品種を含めて我々がテストしたすべての品種で発生する可能性があります。この迅速かつ効率的なアグロバクテリウムVIGSアッセイは、綿のゲノムワイドなレベルでの遺伝子機能の迅速な大規模解析のための非常に強力なツールが用意されています。

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Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

我々は、綿のアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシング（VIGS）アッセイの詳細なプロトコールを提示する。タバコ茎えそウイルス（TRV）由来VIGSベクターは、R​​NAが綿GrCLA1​​、C​​loroplastos alterados 1遺伝子のサイレンシング誘導するために配備されました。サイレンGrCLA1​​によって引き起こさアルビノ表現型は、接種後2週間以内に幼苗期で観察された。

コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

siRNAを介した遺伝子サイレンシングと組み合わせることで生細胞のカルシウムイメージングでは、CAを識別 2 + ER膜のリークチャネルとその調節機序

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

アグロバクテリウム-媒介遺伝子変換、トランスジェニック産生、および米における男性生殖発達の研究への応用

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...